Cardiac ischemia-reperfusion injury : in vitro models and regulation by microRNAs

Abstract

Cardiovascular diseases, including myocardial infarction, are a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Ischemia is a major event during myocardial infarction and results from the deprivation of blood to the heart, caused by the obstruction of a coronary artery. Reperfusion, i.e. the restoration of blood flow following an ischemic event, is the routine clinical procedure. Although reperfusion is essential to preserve the hypoxic myocardium, the sudden reoxygenation of the hypoxic tissues has important adverse effects, including initiation of cell death programs. This phenomenon, known as ischemia-reperfusion injury, is responsible for a fraction of the myocyte death observed following myocardial infarction. Since the human heart has limited regenerative capacity, dead cardiomyocytes are not renewed and, instead, a reparative scarring mechanism occurs. Cardiac fibrosis promoted by cardiac fibroblasts is the principal event underlying scar formation. Upon ischemia-reperfusion injury, cardiac fibroblasts increase their proliferative rate and transform into a contractile and active form, called myofibroblasts. Myofibroblasts are hyper stimulated cells, that produce large amounts of ECM proteins such as collagens, contributing to ECM deposition. Although fibrosis is essential to mending a damaged heart, excessive scarring and persistence of myofibroblasts in the heart is a maladaptive event that leads to ventricle wall stiffness and impairment of heart function. To minimize the effects caused by myocardial infarction, two main therapeutic endpoints could be pursued: i) increase of cardiomyocyte proliferation, to promote replacement of cells lost upon injury, and ii) blocking of excessive scarring process and fibrosis, which contributes to heart dysfunction. MicroRNAs are endogenous small non-coding RNAs that play a major role in the posttranscriptional regulation of gene expression. Currently, 2,588 mature microRNAs are annotated in the human genome (miRBase Release 21, June 2014) and it is estimated that microRNAs might control the expression of ca. 60% of the human genes. MicroRNAs have been shown to be involved in diverse cellular functions such as proliferation, differentiation and apoptosis. The observation that each microRNA can regulate multiple target transcripts, together with the fact that microRNA expression can be modulated by synthetic molecules that mimic or prevent microRNA function (microRNA mimics and inhibitors, respectively), position microRNAs as attractive therapeutic tools. This project is focused on the two main pathological events of myocardial infarction, ischemia-reperfusion and fibrosis, and the potential role of microRNAs in regulating these processes. In the first stage of the project, we optimized experimental conditions to model cardiac ischemia-reperfusion injury in vitro and assessed the impact of injury to cardiomyocyte survival. For this purpose, we used two sources of human cardiomyocytes, both derived from induced pluripotent stem cells. Cells were first exposed to ischemia, achieved by incubation in a hypoxic environment for 24 or 48 hours in the absence of nutrients (except lactate in selected conditions) and subsequently returned to normal culturing conditions, mimicking the reperfusion step. We observed a strong decrease of cardiomyocyte number following ischemia-reperfusion injury, accompanied by changes in cell morphology. In addition, we also optimized a reverse transfection protocol that can be used for transfection of microRNAs in large-scale screenings aimed at clarifying the role of microRNAs in ischemia-reperfusion injury. From these experiments, we were able to demonstrate that hsa-miR-302d-3p strongly induces proliferation of human cardiomyocytes. The second stage of the project was focused on human cardiac fibroblasts. Cardiac fibroblasts were exposed to ischemia-reperfusion injury in vitro using a protocol similar to that applied for cardiomyocytes. Interestingly, our results suggested that ischemiareperfusion leads to a slight increase of cardiac fibroblast proliferation, which is triggered by reperfusion. A reverse transfection protocol for microRNA transfection was also optimized and we performed a “proof-of-principle” pilot screening with 36 microRNAs, aiming at identifying microRNAs controlling myofibroblast activation. Among those, we identified microRNAs that have a strong activity in promoting (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-19b-2-5p, hsamiR- 2052, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-210-3p and hsa-miR-19a-5p) or preventing (hsa-miR- 1281, hsa-miR-130a-5p and hsa-miR-143-5p) myofibroblast activation. Additionally, it was also possible to establish a preliminary correlation between cardiac fibroblast activation and proliferation after microRNA treatment. Our findings indicate that cardiac fibroblasts transformation into myofibroblasts results in a significant decrease of their proliferation rate. Overall, this study has established the experimental conditions for performing largescale screening studies in human cardiomyocytes and cardiac fibroblasts, which will be important to identify novel microRNAs involved in ischemia-reperfusion injury.

As doenças cardiovasculares, nomeadamente o enfarte do miocárdio, são uma das principais causas de morbilidade e mortalidade a nível mundial. A isquémia é o principal acontecimento de um enfarte do miocárdio, e resulta da obstrução de uma artéria coronária, reduzindo o fluxo sanguíneo no coração. A reperfusão é uma intervenção médica na qual o fluxo sanguíneo é restabelecido após isquémia. Apesar de essencial à preservação do miocárdio isquémico, a rápida reoxigenação provocada pela reperfusão tem efeitos devastadores no tecido cardíaco, que incluem a ativação de mecanismos de morte celular. Este fenómeno, conhecido como lesão de isquémia-reperfusão, é em parte responsável pela morte de cardiomiócitos observada após o enfarte do miocárdio. Uma vez que o coração humano é incapaz de se regenerar, os cardiomiócitos danificados não são repostos e, em vez disso, é ativado um mecanismo reparador, conhecido como cicatrização. A fibrose cardíaca promovida por fibroblastos cardíacos é o principal evento subjacente à formação da cicatriz. Após exposição a isquémia-reperfusão, os fibroblastos cardíacos aumentam a sua taxa proliferativa e transformam-se numa forma ativa e contrátil denominada de miofibroblastos. Os miofibroblastos são células híper estimuladas, que produzem grandes quantidades de proteínas de matriz extracelular (MEC), nomeadamente colagénio, contribuindo assim para a deposição de MEC. Embora a fibrose seja essencial para reparar danos cardíacos, a excessiva cicatrização e a permanência de miofibroblastos no coração é um processo patológico que pode conduzir à rigidez da parede do ventrículo, deteriorando a função cardíaca. Para diminuir os efeitos provocados pelo enfarte do miocárdio, duas abordagens terapêuticas podem ser implementadas: i) aumentar a proliferação de cardiomiócitos para promover a substituição das células danificadas durante o enfarte e ii) bloquear a cicatrização excessiva e fibrose cardíaca, que contribuem para a disfunção cardíaca. MicroARNs são pequenos ARN endógenos não-codificantes, que desempenham um papel chave na regulação pós-transcricional da expressão de genes. Atualmente, estão descritos 2588 microARNs maduros no genoma humano (miRBase Release em 21, Junho 2014) e é estimado que estes microARNs possam controlar até 60% da expressão de genes humanos. Foi demonstrado que os microARNs estão envolvidos em diversas funções celulares como a proliferação, diferenciação celular e apoptose. A observação de que cada microARN é capaz de regular vários transcritos alvo, conjuntamente com o facto de que a sua expressão pode ser modulada por moléculas sintéticas que mimetizam ou antagonizam a função de cada microARN (mímicos ou inibidores de microARNs, respetivamente), posicionam os microARNs como atrativas ferramentas terapêuticas. Este projeto foca-se nos dois eventos patológicos associados ao enfarte do miocárdio, nomeadamente, a isquémia-reperfusão e a fibrose cardíaca, e no potencial papel dos microARNs na regulação destes processos. A primeira parte deste projeto visou a otimização das condições experimentais para mimetizar os danos provocados pela isquémia-reperfusão cardíaca, e posteriormente, a avaliação do impacto desses mesmos danos na sobrevivência dos cardiomiócitos. Para tal, foram usados cardiomiócitos humanos de duas origens diferentes, mas ambos derivados de células estaminais pluripotentes induzidas. As células foram expostas a isquémia, obtida através de incubação das células num ambiente hipóxico, durante 24 ou 48 horas na ausência de nutrientes (exceto lactato, em condições específicas), e subsequentemente, devolvidas às condições normais de cultura, simulando o passo da reperfusão. Após a lesão de isquémiareperfusão observou-se um forte decréscimo no número de cardiomiócitos, acompanhado por alterações na morfologia celular. Adicionalmente, foi também possível otimizar o protocolo de transfeção reversa de microARNs que poderá ser usado para a realização de um screening de larga escala com o objetivo de clarificar o papel dos microARNs na lesão de isquémia-reperfusão. Através destas experiências foi possível demonstrar que o hsa-miR- 302d-3p induz um forte aumento da capacidade proliferativa de cardiomiócitos humanos. A segunda fase do projeto focou-se em fibroblastos cardíacos humanos. Os fibroblastos cardíacos foram expostos a lesão de isquémia-reperfusão in vitro usando um protocolo semelhante ao utilizado em cardiomiócitos. Curiosamente, os resultados obtidos sugerem que a isquémia-reperfusão leva a um ligeiro aumento da proliferação de fibroblastos cardíacos, que é estimulado pela reperfusão. O protocolo de transfeção reversa para microARNs foi também otimizado, e foi realizado ainda um screen piloto com 36 microRNAs, que serviu de “prova de princípio” para a validação da tecnologia e identificação de microARNs que controlam a ativação de miofibroblastos. De entre os microRNAs testados, identificámos microARNs com um efeito marcante na estimulação (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR- 19b-2-5p, hsa-miR-2052, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-210-3p e hsa-miR-19a-5p) ou na repressão (hsa-miR-1281, hsa-miR-130a-5p e hsa-miR-143-5p) da ativação de miofibroblastos. Adicionalmente, foi também possível estabelecer uma correlação preliminar entre a ativação e a proliferação dos fibroblastos cardíacos após tratamento com microARNs. Os nossos resultados indicam que a transformação de fibroblastos cardíacos em miofibroblastos resulta num significativo decréscimo da sua taxa de proliferação. Em geral, este estudo estabeleceu as condições experimentais necessárias à realização de um screen em larga escala em cardiomiócitos e fibroblastos cardíacos humanos, que será importante para a identificação de novos microARNs envolvidos na lesão de isquémia-reperfusão.