NT-3/TrkC signalling in the processing of learned fear

Abstract

Fear is a defence response essential for survival. Exaggerated fear that is resistant to extinction, however, is a key feature of most anxiety disorders, which have a very high prevalence in the 21st century (31.1%) and significantly impair the quality of life of patients.Learned fear is studied in rodents mainly through the Pavlovian fear conditioning and extinction paradigm. Here, a neutral stimulus is associated to an aversive stimulus in order to induce a conditioned fear response to the former, characterized by freezing behaviour, while extinction decreases the fear response through repeated non-reinforced exposure of the subject to the neutral stimulus. Nowadays we know that proper fear learning and extinction rely on synaptic plasticity events at the brain fear network – the amygdala, hippocampus and medial prefrontal cortex (mPFC) – that depend on glutamate receptors, intracellular Ca2+ signalling, gene transcription and protein synthesis, among other mechanisms. Neurotrophins are trophic factors essential for the development and function of the nervous system. They activate Trk receptors and recruit downstream intracellular signalling cascades such as the MAPK/Erk, PI3-K/Akt, and PLC-γ pathways. Neurotrophins play an important role in the regulation of synaptic plasticity and have been associated with the processing of fear and with anxiety-related disorders. Previous studies in humans, rodents and non-human primates have linked neurotrophin-3 (NT-3) and its receptor TrkC to anxiety disorders. Moreover, previous studies from the group reported that NT-3/TrkC system plays a role in the regulation of learned fear in a pathologic setting. However, its role in normal physiological conditions was never investigated.In this project, we aim at studying the role of NT-3 and its receptor TrkC in the formation and extinction of a contextual fear memory. For this, wild type C57Bl/6 mice were trained in the contextual fear conditioning and extinction paradigm and the amygdala, hippocampus, and PFC were analysed at different timepoints, after: fear acquisition, fear retrieval, extinction acquisition, and extinction retrieval, that correspond to different processes of fear memory formation (consolidation and reconsolidation). We used Western blot to study the expression levels and activation (measured by phosphorylation levels) of (i) TrkC in total protein extracts from these brain regions during fear consolidation and reconsolidation and of (ii) Erk-1/2 and Akt in the timepoints and brain regions where alterations in TrkC activation have been observed. Moreover, we performed immunofluorescence in synaptoneurosomes isolated from the amygdala and the hippocampus after fear extinction acquisition in order to assess the synaptic localization of TrkC during fear extinction consolidation, and we performed Western blot in protein extracts obtained from these synaptoneurosomes to quantify the expression and phosphorylation of TrkC specifically at the synapse.We found a correlation between the formation of a fear memory and the overall downregulation of TrkC activation in the fear circuit. Interestingly, during fear reconsolidation, TrkC inactivation in the hippocampus was accompanied by a downregulation of Erk-1/2 activation. During the extinction consolidation and reconsolidation phases, where we had previously observed alterations in TrkC activation in animals that successfully extinguished the fear memory, we did not obtain any relevant differences in the activation of Erk-1/2 and Akt. Finally, we observed a recruitment of TrkC receptor to amygdala synapses in response to extinction training. Our results support a role for TrkC in fear learning and extinction. We are currently performing a set of experiments to manipulate TrkC activation in vivo to show a causal relationship and prove that TrkC is necessary and sufficient for fear memory formation. We are also studying the PLC-γ pathway in the brain regions and timepoints where we observed alterations in TrkC activation. Moreover, we are investigating the expression and activation of the Erk-1/2 and Akt and the synaptic expression of glutamate receptor subunits in amygdala and hippocampus synaptoneurosomes after fear extinction training. In this project, we laid down a foundation for the role of TrkC in contextual fear learning and extinction in wild type mice, which will allow us to expand on the specific mechanisms through which NT-3/TrkC regulate fear processes and provide us a better understanding of their contribution to anxiety and fear-related disorders.

O medo é uma resposta de defesa, essencial à sobrevivência. Contudo, o medo exagerado e resistente a processos de extinção, é uma componente central a muitos dos transtornos de ansiedade. Os transtornos de ansiedade têm uma prevalência muito alta no século XXI (31,1%) e afectam consideravelmente a qualidade de vida dos pacientes.Em roedores, o medo aprendido é estudado principalmente com recurso ao paradigma de condicionamento de medo e extinção de Pavlov. Aqui, um estímulo neutro é associado com um estímulo aversivo, de forma a induzir uma resposta de medo condicionada ao estímulo inicialmente neutro, caracterizada por imobilização, enquanto que a extinção diminui esta resposta de medo através de exposição repetida e não-reforçada do indivíduo ao estímulo neutro. Hoje sabe-se que o medo aprendido e a sua respetiva extinção dependem de eventos de plasticidade sináptica no circuito cerebral que regula o medo – a amígdala, o hipocampo e o córtex pré-frontal médio (mPFC) – que por sua vez dependem de receptores do glutamato, sinalização intracelular por Ca2+, transcrição de genes e síntese de proteínas, em conjunto com outros mecanismos.As neurotrofinas são factores tróficos essenciais para o desenvolvimento e função do sistema nervoso. Activam receptores Trk e recrutam cascatas de sinalização intracelular tais como as vias MAPK/Erk, PI3-K-Akt e PLC-γ. As neurotrofinas têm um papel importante na regulação da plasticidade sináptica e têm sido associadas ao processamento do medo e a transtornos de ansiedade. Estudos prévios em humanos, roedores e primatas não-humanos mostraram uma associação da neurotrofina-3 (NT-3) e o seu receptor TrkC a transtornos de ansiedade. Além disso, a nossa própria investigação mostrou que o sistema NT-3/TrkC desempenha um papel na regulação do medo aprendido em condições patológicas. Contudo, o seu papel em condições fisiológicas nunca foi investigado.Neste projeto, temos como objetivo estudar o papel da NT-3 e do seu recetor TrkC na formação e extinção de uma memória de medo. Com este fim, murganhos da estirpe C57Bl/6 selvagem foram treinados no paradigma de condicionamento de medo contextual e respetiva extinção, e a amígdala, o hipocampo e o PFC foram analisados em diferentes momentos após: a aprendizagem do medo, a memória do medo, a aprendizagem da extinção e a memória da extinção, que correspondem a diferentes processos da formação da memória de medo (consolidação e reconsolidação). Realizámos experiências de Western blot para estudar os níveis de expressão e a ativação (medida pelos níveis de fosforilação) (i) do TrkC em extratos totais de proteínas destas regiões cerebrais durante a consolidação e reconsolidação do medo e (ii) do Erk-1/2 e Akt nas regiões cerebrais e processos onde tínhamos previamente observado alterações na ativação do TrkC. Finalmente, em sinaptoneurosomas isolados da amígdala e hipocampo de murganhos treinados na aquisição da extinção do medo, realizámos imunofluorescência de forma a avaliar a localização sináptica do TrkC durante a consolidação da extinção do medo, e realizámos experiências de Western blot em extratos de proteína obtidos destes sinaptoneurosomas para quantificar a expressão e fosforilação do TrkC especificamente ao nível da sinapse.Os resultados obtidos mostraram uma correlação entre a formação de uma memória de medo e a diminuição generalizada da atividade dos receptores TrkC no circuito do medo. Além disso, durante a reconsolidação do medo a inactivação do TrkC no hipocampo é acompanhada por uma diminuição da ativação de Erk-1/2. Durante as fases de consolidação e reconsolidação da extinção, onde tínhamos previamente observado alterações na ativação do TrkC em animais que extinguem a memória de medo com sucesso, não observámos diferenças relevantes na atividade da Erk-1/2 e da Akt. No entanto, e muito importante, observámos um recrutamento de TrkC para as sinapses da amígdala em resposta ao treino de extinção do medo. Os nossos resultados apontam para um papel do TrkC na aprendizagem e extinção do medo. Presentemente, estamos a realizar um conjunto de experiências para manipular a ativação do TrkC in vivo com o objetivo de provar que o TrkC é necessário e suficiente para a formação de uma memória de medo. Também estamos a estudar a via PLC-γ nas regiões cerebrais e timepoints em que observámos alterações na ativação do TrkC. Além disso, estamos a investigar a expressão e ativação de Erk-1/2 e da Akt, assim como a expressão sináptica de subunidades dos recetores de glutamato em sinaptoneurosomas da amígdala e do hipocampo após o treino no paradigma de extinção do medo. Com este projeto estamos a construir uma base para entender o papel do NT-3/TrkC no medo dependente do contexto, e a sua extinção, em condições fisiológicas, usando murganhos selvagem, o que nos vai permitir expandir o nosso conhecimento acerca dos mecanismos específicos através dos quais a NT-3 e o TrkC regulam processos de medo e permitir-nos-à uma melhor compreen