Assessing the role of the secretome of brain metastatic breast cancer cells in the phenotypic shift and oxidative response of microglia

Abstract

Introduction: The Triple Negative Breast Cancer (TNBC) and HER2+ breast cancer subtypes have a higher incidence of brain metastasis. It is well recognized that primary tumors prepare the microenvironment of distant organs, the so-called premetastatic niche (PMN) before metastasis onset. Microglia, as the major innate immune cells of the brain, are likely to take part in the metastatic process, but the underlying mechanisms are poorly understood. Aims: We intend to explore the microglial response when exposed to the secretome of brain metastatic breast cancer cells (BMBCCs), with a focus on oxidative stress, and the regulating role of extracellular zinc on microglia activation phenotype. We also aim to evaluate whether BCC’s-induced MC activation may lead to endothelial cell dysfunction. Materials and Methods: Conditioned mediums (CMs) were collected from MDA-MB-231 (TNBC) and JIMT-1 (HER2+) cells and their corresponding brain-tropic variants. Human microglia cells (HMC3) were exposed to these CMs and assayed for NO production by the Griess assay, expression of inflammatory mediators and oxidative stress markers by RT-qPCR, production of intracellular reactive oxygen species (iROS) with the H2DCFDA probe, proliferation rate with WST-1 reagent, and motility by a scratch assay. Activation of stress-activated protein kinases (SAPKs) was evaluated by Western Blot. Zinc depletion experiments were carried out using the chelating agent DTPA. The hCMEC/D3 monolayer integrity was assessed by measuring the transendothelial flux of the 4kDa-FITC probe and the Transendothelial Electric Resistance (TEER).Results: The exposure of MCs to the CMs of BC cells leads to a significant increase in NO and iROS generation, as well as a higher proliferation rate and reduced motility, being the most pronounced achieved with the CM from TN brain-tropic cells. Gene expression of inflammatory mediators and SAPKs signaling is also elicited, pointing to an M1-like phenotype under the effect of BCC’s secretome exposure. ROS production is not regulated by NOX activity but rather by the mitochondria considering the upregulation of UCP2. The depletion of extracellular Zn2+ impaired the NO and iROS generation by MCs and their proliferation. Conversely, inflammatory signaling was markedly upregulated and the NRF2 antioxidant gene appears to denote an early state of oxidative distress. The barrier properties conferred by ECs were disrupted when incubated with the secretome of activated MCs. Conclusion: MCs react to the secretome of metastatic breast cancer cells by acquiring an M1-like phenotype, as indicated by the increased production of NO, iROS, and the predominance of pro-inflammatory cytokines. Zinc chelation with DTPA reduced the production of iROS and NO generation by MCs while exacerbating the inflammatory environment with anti- and pro-inflammatory mediators. These findings highlight the contribution of Zn2+ in eliciting a microglia response. Further studies are required to understand how these findings can be related to the PMN formation.

Introdução: Os subtipos de cancro da mama triplo negativo (CMTN) e HER2+ apresentam maior incidência de metástases cerebrais. É sabido que os tumores primários preparam o microambiente de órgãos distantes, o chamado nicho pré-metastático (NPM), antes do início da metástase. Presume-se que a microglia, como a principal célula imune inata do cérebro, tenha um papel ativo no processo metastático, mas os mecanismos que lhe estão subjacentes não estão completamente esclarecidos.Objetivos: Pretendemos explorar a resposta da microglia quando exposta ao secretoma de células de cancro da mama metastático do cérebro (CCMMC), com foco no stress oxidativo, e no papel regulador do zinco extracelular no fenótipo de ativação da microglia. Pretendemos ainda avaliar se a ativação da microglia, induzida por CCMMC pode levar à disfunção de células endoteliais.Materiais e Métodos: Os meios condicionados (MCs) foram colhidos a partir de células MDA-MB-231 (CMTN) e JIMT-1 (HER2+) e das variantes cerebrais correspondentes. Células da microglia humana (HMC3) foram expostas a esses MCs e testadas quanto à produção de ON pelo ensaio de Griess, expressão de mediadores inflamatórios e marcadores de stress oxidativo por RT-qPCR, produção de espécies reativas intracelulares de oxigénio (iROS) com a sonda H2DCFDA, taxa de proliferação com o reagente WST-1 e motilidade por um ensaio de scratch. A ativação de proteínas quinases ativadas por stress (PQASs) foi avaliada por Western Blot. Experiências de depleção de zinco foram realizadas usando o agente quelante DTPA. A integridade da monocamada de células hCMEC/D3 foi avaliada medindo o fluxo transendotelial da sonda 4kDa-FITC e a Resistência Elétrica Transendotelial (TEER).Resultados: A exposição da microglia aos MCs das CCMMC leva a um aumento significativo na geração de ON e iROS, bem como a uma maior taxa de proliferação e redução da motilidade, sendo o mais pronunciado alcançado com o MC de células trópicas cerebrais TN. A expressão génica de mediadores inflamatórios e sinalização por PQASs também é induzida, apontando para um fenótipo do tipo M1 sob o efeito da exposição ao secretoma de CCMMC. A produção de ROS não é regulada pela atividade de NOX, mas sim pela mitocôndria, considerando a regulação positiva de UCP2. A depleção de Zn2+ extracelular diminuiu a produção de ON e iROS pela microglia e a sua proliferação. Além disso, observou-se um aumento da resposta inflamatória e de stress oxidativo indicado pela sobreexpressão do gene antioxidante NRF2. Observou-se igualmente uma perturbação das propriedades de barreira conferidas pelas células endoteliais quando incubadas com o secretoma de células da microglia ativadas.Conclusão: A microglia reage ao secretoma de células metastáticas do cancro da mama adquirindo um fenótipo semelhante ao M1, conforme indicado pelo aumento da produção de ON, iROS e pela predominância de citocinas pró-inflamatórias. A quelação de zinco com DTPA reduziu a produção de iROS e geração de ON pela microglia, enquanto exacerbou o ambiente inflamatório com mediadores anti e pró-inflamatórios. Estes resultados destacam a contribuição do Zn2+ na indução de uma resposta da microglia. São necessários mais estudos para entender como estas descobertas podem estar relacionadas com a formação do NPM.