Avaliação do potencial terapêutico de moduladores epigenéticos na leucemia linfocítica crónica

Abstract

A leucemia linfocítica crónica (LLC) é uma neoplasia linfoproliferativa de células B maduras, caracterizada pela acumulação de linfócitos B neoplásicos no sangue, na medula óssea e nos tecidos linfoides secundários. Na LLC estão presentes diversas alterações genéticas como alterações cromossómicas, mutações, mas também epigenéticas como alterações na expressão de miRNAs, modificações da acetilação das histonas e da metilação do DNA. As alterações cromossómicas mais frequentes incluem a deleção 13q, a deleção 17p, a deleção 11q e a trissomia do cromossoma 12. Além disso, os miRNAs 15a e 16-1 podem estar ausentes, por exemplo, na deleção 13q, ou ser regulados negativamente ou alterados em aproximadamente 60% dos casos de LLC e são disfuncionais em casos de LLC familiar. Outras alterações epigenéticas incluem a alteração da metilação do DNA e a modificação das histonas, sendo que esta metilação anómala poderá corresponder ao evento inicial desta patologia. As modificações nas histonas determinam a natureza da cromatina sendo estas alterações as responsáveis pelo empacotamento da cromatina e o acesso à informação genética. Como consequência, da desacetilação das histonas e da hipermetilação do DNA, ocorre o silenciamento de diversos genes com consequente aumento de viabilidade e resistência à apoptose características das células cancerígenas da LLC. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial terapêutico de moduladores epigenéticos [agentes hipometilantes (azacitidina e decitabina) e inibidores das desacetilases das histonas (vorinostat e panobinostat)] numa linha celular de LLC. Neste sentido, a linha celular HG3 foi incubada durante 72h na ausência e na presença dos moduladores epigenéticos em monoterapia e em combinação terapêutica. Procedeu-se à avaliação da atividade metabólica recorrendo ao ensaio metabólico da resazurina. O ciclo celular foi analisado através de citometria de fluxo por marcação com iodeto de propídio (PI)/RNase. O tipo de morte celular foi avaliado também por citometria de fluxo por marcação com Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) e por microscopia ótica, através da análise morfológica recorrendo à coloração de Giemsa. Na avaliação da atividade metabólica, os resultados demonstraram que no caso da azacitidina, do vorinostat e do panobinostat a diminuição da atividade metabólica é dependente do tempo e da dose de fármaco, enquanto que, no caso da decitabina a diminuição da atividade metabólica é dependente apenas do tempo. Neste ensaio, no tempo de incubação de 72h, o IC50 da azacitidina foi de 2,135 μM, da decitabina de 2,948 μM, do vorinostat de 0,4709 μM e do panobinostat foi de 5,486 nM. Além disso verificou-se que, a azacitidina, a decitabina e o panobinostat demonstram ter um efeito citotóxico, enquanto o vorinostat levou a um aumento não significativo da morte celular. Além do efeito citotóxico, a azacitidina revelou um efeito citostático com bloqueio das células em fase G0/G1. De um modo semelhante, a decitabina e o vorinostat induziram bloqueio do ciclo celular em fase G0/G1 e G2/M. Por outro lado, o panobinostat não induziu efeitos muito significativos a nível do ciclo celular. No caso das combinações terapêuticas, em todas ocorreu uma maior redução da atividade metabólica em comparação com a monoterapia, tendo sido observado um efeito sinérgico de adição. Nas células tratadas com combinações terapêuticas com decitabina observou-se uma maior percentagem de células em morte celular por apoptose, enquanto que, nas combinações com azacitidina não ocorreu um aumento significativo de morte celular. Todas as combinações terapêuticas induziram bloqueio do ciclo celular em fase G0/G1 e G2/M, revelando um efeito citostático. No entanto, a associação da azacitidina com vorinostat não revelou efeitos significativos no ciclo celular. Em suma, podemos concluir que os moduladores epigenéticos estudados em monoterapia ou em combinação podem constituir uma abordagem terapêutica para o tratamento da leucemia linfocítica crónica.

The chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a mature B cell lymphoproliferative neoplasm characterized by the accumulation of neoplastic B lymphocytes in the blood, bone marrow and secondary lymphoid tissues. In CLL, are present several genetic alterations, such as chromosomal alterations, mutations, and epigenetic alterations, such as alterations in the expression of miRNAs, changes in histone acetylation and DNA methylation. The most frequent chromosomal alterations include the 13q deletion, the 17p deletion, the 11q deletion and chromosome 12 trisomy. Furthermore, miRNAs 15a and 16-1 may be absent, for example, in the 13q deletion, or be down-regulated or altered in approximately 60% of CLL cases and are dysfunctional in familiar CLL cases. Other epigenetic alterations include the alteration of DNA methylation and the modification of histones, and this anomalous methylation may correspond to the initial event of this pathology. Histone modifications determine the nature of chromatin, and these alterations are responsible for chromatin packaging and access to genetic information. As a consequence of histone deacetylation and DNA hypermethylation, several genes are silenced, with a consequent increase in the viability and resistance to apoptosis, characteristic of CLL cancer cells. Thus, this work, evaluated the therapeutic potential of epigenetics modulators [hypomethylating agents (azacytidine and decitabine) and histone deacetylases inhibitors (vorinostat and panobinostat)] in a CLL cell line. In this sense, the HG3 cell line was incubated for 72 hours in the absence and presence of epigenetic modulators in monotherapy and in therapeutic combination. The metabolic activity was evaluated using the resazurin metabolic assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry by labeling with propidium iodide (PI)/RNase. The type of cell death was also evaluated by flow cytometry using labeling Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) and by optical microscopy, through morphological analysis using Giemsa staining. In the evaluated of metabolic activity, the results demonstrated that, in the case of azacytidine, vorinostat and Panobinostat, the decrease in metabolic activity is time- and dose- dependent, while in the case of decitabine the decrease in metabolic activity is dependent only of time. In this assay, at an incubation time of 72 hours, the IC50 of azacytidine was 2.135 μM, decitabine 2.948 μM, vorinostat of 0.4709 μM and Panobinostat of 5.486 nM. Furthermore, azacytidine, decitabine and panobinostat were found to have a cytotoxic effect, whereas vorinostat led to a non-significant increase in cell death. In addition to the cytotoxic effect, azacytidine revealed a cytostatic effect with blocking of cells the G0/G1 phase. Similarly, decitabine and vorinostat induced cell cycle blockage in G0/G1 and G2/M phase. For the other side, panobinostat did not lead to very significant effects at the cell cycle level.In the case of therapeutic combinations, in all of them there was a greater reduction in metabolic activity compared to monotherapy, and a synergistic addition effect was observed. In cells treated with therapeutic combinations with decitabine, a higher percentage of apoptostic cells was observed, while in combinations with azacytidine there was not significant increase in cell death. All therapeutic combinations induced a arrest in G0/G1 and G2/M phases, revealing a cytostatic effect. However, the combination of azacytidine with vorinostat did not show significant effects on the cell cycle. In summary, we can conclude that epigenetic modulators in monotherapy or in combination can constitute a therapeutic approach for the treatment chronic lymphocytic leukemia.