Influence of oxidative stress and type 2 diabetes mellitus on neuronal function and metabolism : the neuroprotective role of insulin

Abstract

Nas últimas duas décadas as vias de sinalização pela insulina no cérebro tornaram-se um novo tema de investigação. A disfunção da sinalização pela insulina tem sido associada a inúmeras doenças neurodegenerativas e a défices de aprendizagem e memória. O objectivo principal dos nossos estudos foi analisar o papel neuroprotector da insulina na neurotransmissão e na função e sobrevivência neuronal em condições de stresse oxidativo e de diabetes. Como modelos neuronais in vitro utilizámos fracções sinaptossomais de cérebro de rato adulto, obtidas de ratos Wistar não diabéticos e de ratos Goto-Kakizaki (GK), diabéticos tipo 2 (Capítulos 3 e 4), bem como neurónios corticais em cultura, obtidos de embriões de ratos Wistar (Capítulos 5, 6 e 7). Tanto em sinaptossomas como em neurónios corticais, o stresse oxidativo, induzido pelo par oxidante ascorbato/sulfato de ferro(II), causou um aumento da oxidação lipídica e proteica (Capítulos 3, 4 e 5). Em condições oxidantes, a insulina preveniu o decréscimo da tomada de ácido -aminobutírico (GABA) e glutamato e estimulou os níveis extra-sinaptossomais de ambos os aminoácidos em sinaptossomas de ratos não diabéticos (Capítulo 3). Estes resultados sugerem que a insulina modula o transporte de neurotransmissores, quer directamente, como parece ocorrer em condições controlo, quer através do decréscimo dos níveis de A TP e consequente reversão dos transportadores de aminoácidos, como parece ocorrer em condições de stresse oxidativo. Na diabetes tipo 2, a insulina não preveniu o aumento das substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) induzido por ascorbato/Fe2+ (Capítulo 4), sugerindo que outros mecanismos, independentes de um efeito directo na peroxidação lipídica membranar, poderão mediar os efeitos induzidos pela insulina. Curiosamente, a diminuição do potencial de membrana e da razão ATP/ADP induzidos pela diabetes não foram acompanhados por alterações no transporte de GABA ou glutamato. Para além disso, a insulina aumentou a tomada de GABA e glutamato em sinaptossomas de ratos GK. Em condições de oxidação, observou-se um decréscimo da tomada de ambos os neurotransmissores e um aumento dos níveis extra-sinaptossomais de glutamato e da razão ATP/ADP em ratos GK. O tratamento com insulina preveniu a diminuição da tomada de GABA induzi da pelo ascorbato/Fe2+ através do decréscimo do GABA extra¬sinaptossomal. Estes resultados sugerem que a insulina modula o transporte sinaptossomal de GABA e/ou glutamato podendo, desta forma, desempenhar um papel neuroprotector em condições de oxidação e/ou diabetes. Em culturas de neurónios corticais, a insulina preveniu a morte celular por apoptose e necrose induzida por stresse oxidativo (Capítulo 5). A insulina também inibiu a oxidação lipídica e proteica induzida por ascorbato/Fe2+, nomeadamente a formação de aductos de 4-hidroxinonenal no transportador de glucose GLUT3, sugerindo que este peptídeo poderá interferir com o metabolismo da glucose. Adicionalmente, o tratamento com insulina preveniu largamente a diminuição dos níveis intracelulares de ácido úrico e glutatião reduzido (GSH)/glutatião oxidado (GSSG) associada ao stresse oxidativo, num processo mediado pela cinase do inositol-3-fosfato (PI-3K) ou pela cinase regulada extracelularmente (ERK). A hormona também estimulou a actividade da redutase do glutatião (GRed) e inibiu a actividade da peroxidase do glutatião (GPx) em condições de stresse oxidativo, reforçando a hipótese de que a neuroprotecção pela insulina poderá estar relacionada com a modulação do ciclo redox do glutatião. A insulina também estimulou a tomada e metabolismo da glucose neuronal em piruvato, contribuindo para a reposição dos níveis intracelulares de ATP e fosfocreatina (P~Cr) após stresse oxidativo (Capítulo 6). A hormona aumentou ainda os níveis intracelulares e diminuiu os níveis extracelulares de adenosina (ADO), contrabalançando assim o efeito do ascorbato/Fe2+, num processo aparentemente mediado pelas vias de sinalização da PI-3K e ERK. Em condições de stresse oxidativo, a ADO extracelular resultou preferencialmente da libertação e catabolismo do ATP, sendo amplamente inibida após o bloqueio da enzima ecto-5' -nucleotidase. A insulina também regulou os níveis extracelulares de ADO após stresse oxidativo através da interferência com a libertação de A TP. Isto sugere que a neuroprotecção pela insulina contra o stresse oxidativo envolve: 1) estimulação da tomada e metabolismo da glucose, aumentando os níveis energéticos e a ADO intracelular, culminando na formação de ácido úrico, e 2) decréscimo dos níveis extracelulares de ADO, podendo desta forma prevenir a activação de receptores facilitatórios para a ADO. Finalmente, estudaram-se as vias de sinalização mediadas pelos receptores para a insulina e o factor de crescimento insulínico-I (IR e IGF -1R, respectivamente) em neurónios corticais. A exposição à insulina preveniu a diminuição da fosforilação de tiro sina (Tyr) de ambos os receptores causada pelo stresse oxidativo (Capítulo 7). A insulina também promoveu a activação da Akt e diminuiu a forma activa da GSK-3β após oxidação neuronal. A inibição da GSK-3β pela PI-3K/Akt tem sido associada à estimulação da síntese proteica e à inibição da apoptose. Desta forma, a insulina preveniu o aumento da expressão da GPx-l e o decréscimo da expressão da hexocinase-II (Hxk-II) provocado pelo stresse oxidativo, suportando as nossas evidências do aumento da actividade antioxidante do ciclo redox do glutatião e da estimulação da glicólise (Capítulos 5 e 6). A insulina também preveniu o decréscimo da expressão da Bcl-2 e o aumento da expressão da cysteine-aspartic acid protease-3 (caspase-3), abolindo a actividade da caspase-3 induzida pelo stresse oxidativo e protegendo contra a fragmentação do DNA. Nesta perspectiva, a activação do IR e IGF-1R mediada pela insulina estimula a via de sinalização da PI-3K/Akt e inibe a da GSK-3β, regulando a expressão de proteínas envolvidas nas defesas antioxidantes neuronais, no metabolismo da glucose e na prevenção da apoptose. Assim, a insulina poderá exercer um papel protector contra os efeitos deletérios do stresse oxidativo nos neurónios. Em conclusão, a insulina modula o transporte sinaptossomal de GABA e/ou glutamato, podendo ter um papel neuromodulador em condições oxidantes e/ou de diabetes. Os efeitos protectores da insulina poderão ser mediados pela activação do IR e IGF-1R neuronal, estimulando a via de sinalização da PI-3K/Akt e inibindo a da GSK¬3β. Assim, a alteração da expressão de proteínas envolvidas nas defesas antioxidantes neuronais (e.g. GPx), metabolismo da glucose (e.g. Hxk-II) e prevenção da apoptose (e.g. caspase-3, Bcl-2) poderá explicar a neuroprotecção induzida pela insulina contra o stresse oxidativo.

In the last two decades insulin signalling in the brain has emerged as a novel field of research. Dysfunction in insulin signalling has been linked to numerous neurodegenerative di se ases and impairment in leaming and memory. The main goal of our studies was to analyse the neuroprotective effect of insulin on neurotransmission and neuronal function and survival associated with oxidative stress and diabetes. As in vitro neuronal models we used adult rat brain synaptosomal fractions, obtained from non-diabetic Wistar and type 2 diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats (Chapters 3 and 4), and cultured cortical neurons obtained from Wistar rat embryos (Chapters 5, 6 and 7). Oxidative stress, induced by the oxidant pair ascorbate/ferrous sulphate, in both synaptosomes and cortical neurons, yielded lipid and protein oxidation (Chapters 3, 4 and 5). Under oxidizing conditions, treatment with insulin prevented the decrease in both -aminobutyric acid (GABA) and glutamate uptake and increased their extrasynaptosomallevels in non-diabetic rat synaptosomes (Chapter 3). This suggested that insulin modulates neurotransmitter transport, either directly, as occurs under control conditions, or via a decrease in ATP levels and the subsequent reversal of the amino acid transporters, as seems to occur under oxidative stress conditions. Under type 2 diabetes, insulin was not able to prevent ascorbate/Fe2+-induced increase in thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) (Chapter 4), suggesting that other mechanisms, rather than a direct effect in membrane lipid peroxidation, may mediate insulin action. Interestingly, the decrease in membrane potential and ATP/ADP induced by diabetes was not accompanied by changes in GABA or glutamate transport. Moreover, insulin increased the uptake of both GABA and glutamate in GK rat synaptosomes. Upon oxidation, a decrease in the uptake of both neurotransmitters and an increase in extrasynaptosomal glutamate levels and in ATP/ADP ratio was observed in GK rats. Insulin treatment prevented ascorbate/Fe2+-induced decrease in GABA accumulation, by decreasing extrasynaptosomal GABA. These results suggest that insulin modulates synaptosomal GABA and/or glutamate transport under oxidizing and/or diabetic conditions. In cultured cortical neurons, insulin prevented both necrotic and apoptotic cell death induced by oxidative stress (Chapter 5). Insulin also inhibited ascorbate/Fe2+-mediated lipid and protein oxidation, namely the formation of 4-hydroxynonenal adducts on GLUT3 glucose transporter, suggesting that this peptide can interfere with glucose metabolism In addition, insulin treatment largely prevented oxidative stress-induced decrease in intracellular uric acid and reduced glutathione (GSH)/oxidized glutathione (GSSG) levels, in a process mediated by phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) or extracellular-regulated kinase (ERK). The hormone also stimulated glutathione reductase (GRed) and inhibited glutathione peroxidase (GPx) activities under oxidative stress, further supporting that insulin neuroprotection was related with the modulation of the glutathione redox cycle. Interestingly, insulin also stimulated neuronal glucose uptake and metabolism into pyruvate, restoring intracellular ATP and phosphocreatine (P~Cr) after oxidative stress (Chapter 6). It also counteracted the effect of ascorbate/Fe2+ by increasing intracellular and decreasing extracellular adenosine (ADO), which was apparently mediated by PI¬-3K and ERK signalling pathways. Extracellular ADO under oxidative stress derived preferentially from ATP release and catabolism, being largely inhibited after blockade of ecto-5' -nucleotidase. Insulin further regulated extracellular ADO after oxidative stress by interfering with ATP release. This suggested that insulin neuroprotection against oxidative stress-mediated damage involves: 1) stimulation of glucose uptake and metabolism, increasing energy levels and intracellular ADO and, ultimately, uric acid formation, and 2) a decrease in extracellular ADO, which may reduce the facilitatory activity of ADO receptors. Finally, both insulin and insulin-like growth factor-l receptors (IR and IGF-1R, respectively) signalling pathways were studied in cortical neurons. Treatment with insulin prevented the decrease in tyrosine (Tyr) phosphorylation of IR and IGF-lR induced by oxidative stress (Chapter 7). Insulin also promoted Akt activation and decreased the active form of GSK-3β upon neuronal oxidative stress. Inhibition of GSK-3β by PI-3K/Akt has been reported to stimulate protein synthesis and decrease apoptosis. Hence, insulin prevented the increase in expression of GPx-l and a decrease in expression of hexokinase-II (Hxk-II) caused by oxidative stress, supporting our findings of increased antioxidant activity of glutathione redox cycling and glycolysis stimulation (Chapter 5 and 6). Insulin also precluded the decrease in expression of Bcl-2 and the increase in caspase-3 expression, thus abolishing caspase-3 activity induced by oxidative stress and protecting against DNA fragmentation. Hence, insulin-mediated activation of IR and IGF-IR stimulate PI-3K/Akt and inhibit GSK-3β signalling pathways, modifying the expression of proteins involved in neuronal antioxidant defence, glucose metabolism and prevention against apoptosis, and thus protecting against deleterious effects induced by oxidative stress in neurons. Taken together, we can conclude that insulin modulates synaptosomal GABA and/or glutamate transport, thus having a neuromodulatory role under oxidizing and/or diabetic conditions. Protective effects of insulin may be mediated by the activation of neuronal IR and IGF-IR, thus stimulating PI-3K/Akt and inhibiting GSK-3 signalling pathways. Therefore, changes in expression of proteins involved in neuronal antioxidant defence (e.g. GPx), glucose metabolism (e.g. Hxk-II) and prevention against apoptosis (e.g. caspase-3, Bcl-2) may underlie insulin neuroprotection against oxidative stress.