Heart ischemia gives a second life to Cx43: Novel roles ascribed to Cx43 that go beyond gap junction intercellular communication

Abstract

A well-balanced intercellular communication between the different cells within the myocardium is vital for the maintenance of cardiac homeostasis and function. In the heart, connexin43 (Cx43)-containing gap junction (GJ) channels localized at the intercalated discs (IDs) ensure the passage of small molecules between adjacent cardiomyocytes, contributing for the synchronized heart beating. At longer distances, intracardiac communication rely on extracellular vesicles (EVs), which may also contain Cx43 channels at their surface. Besides, mounting evidence associates Cx43 with myriad channel-independent functions, including cell adhesion, differentiation and gene expression. Although abnormal expression and heterogeneous redistribution of Cx43 have been implicated in several cardiac disorders, including myocardial infarction and heart failure, the underlying mechanisms and regulatory proteins remain largely unknown. Hence, we applied unbiased proteomics to map the Cx43 interactome in rat hearts, in basal conditions and following ischemia and ischemia/reperfusion (I/R). Our results demonstrate that Cx43 binds to a large number of unforeseen proteins involved in various biological processes, such as intracellular trafficking, metabolism and transcription. Grounded on our proteomic data, we identified the interaction of Cx43 with the endocytic regulators Eps15 homology domain-containing proteins (EHDs). Our results showed that EHD1 participated in the internalization and lateralization of Cx43 in vitro. Moreover, the association between Cx43 and EHDs was increased in the ischemic heart, implicating EHDs in the pathological remodeling of Cx43 channels. Despite considerable progress in the definition of EV biogenesis mechanisms, selective EV protein sorting remains obscure, particularly under pathological conditions. Hence, we used Cx43 as a model substrate, which enabled the identification of ubiquitin as the signal driving the sorting of EV-Cx43. In addition, the presence of Cx43 in EVs determined the selective incorporation of miRNAs into EVs and facilitated the delivery of doxorubicin to tumor cells, with a concomitant reduced cardiotoxicity in vivo, ascribing a role for Cx43 in targeted EV-cell communication. Finally, we showed that the expression of Cx43 significantly impacted on the cellular transcriptome, which was correlated with the presence of Cx43 channels at the inner nuclear membrane. Strikingly, ischemia downregulated both the release of Cx43 in EVs, as well as the amount of Cx43 in the nucleus, suggesting that non-canonical functions of Cx43, beyond GJ-mediated intercellular communication, are compromised under pathological conditions. Overall, the results presented in this thesis contribute to a better understanding of the channel-dependent and -independent functions of Cx43 in the heart, together with the identification of the binding partners regulating some of these functions. These data may bring new perspectives for the design of novel diagnostic and therapeutic strategies for cardiovascular disorders.

Uma comunicação intercelular eficiente entre os diferentes tipos de células que constituem o miocárdio é essencial para a manutenção da homeostasia e função cardíacas. No coração, a existência de junções comunicantes (JC), formadas por uma proteína denominada conexina43 (Cx43), nos discos intercalares, garante a passagem de pequenas moléculas, incluindo iões, entre cardiomiócitos adjacentes, assegurando, por exemplo, a propagação rápida do potencial de ação, vital para uma contração eficiente do músculo cardíaco. A maiores distâncias, a comunicação intracardíaca é assegurada através da libertação de factores solúveis e vesículas extracelulares (VEs), que também podem conter canais de Cx43 à sua superfície. Além do seu papel enquanto canal, evidências mais recentes têm associado uma série de outras funções à Cx43, tais como o controlo da adesão celular, diferenciação e transcrição. Embora uma expressão anormal e redistribuição heterogénea da Cx43 tenham sido implicadas em várias doenças cardíacas, incluindo o enfarte do miocárdio e a insuficiência cardíaca, os mecanismos subjacentes, bem como as proteínas envolvidas na sua regulação, permanecem amplamente desconhecidos. Deste modo, no presente trabalho realizámos um ensaio de proteómica com vista à caracterização do interactoma da Cx43 em corações de rato, em condições basais e em resposta à isquémia e isquémia/reperfusão (I/R). Os resultados obtidos neste estudo permitiram identificar um conjunto de proteínas que não tinham sido anteriormente reportadas, envolvidas em diversos processos biológicos, como o tráfego intracelular, metabolismo e expressão genética. Com base nestes dados, identificámos a interação da Cx43 com membros de uma família de proteínas envolvida na regulação da via endocítica, as Eps15 homology domain-containing proteins (EHDs). Demonstrámos que a EHD1 participa na internalização e lateralização da Cx43 in vitro, e ainda que a associação entre a Cx43 e as EHDs aumenta no coração em isquémia, atribuindo, assim, um papel importante a estas proteínas na remodelação patológica dos canais de Cx43. Apesar dos progressos consideráveis na definição dos mecanismos de biogénese das VEs, os sinais que regulam a incorporação selectiva de proteínas nestas vesículas permanecem por esclarecer, particularmente em condições patológicas. Assim, neste trabalho, utilizando a Cx43 como substrato modelo, identificámos a ubiquitina como o sinal que conduz à libertação de Cx43 em VEs. Além disso, a presença de Cx43 mostrou-se determinante não só para a incorporação seletiva de miRNAs em VEs, como também para facilitar a libertação de doxorrubicina encapsulada em VEs a células tumorais, com uma concomitante redução da sua cardiotoxicidade in vivo. Deste modo, os nossos resultados implicam a Cx43 na comunicação entre as VEs e as células alvo. Finalmente, mostrámos que a Cx43 está presente na membrana nuclear interna , na forma de canais, e que a expressão de Cx43 tem um impacto significativo no transcriptoma das células. Surpreendentemente, a isquémia levou a uma diminuição da libertação de Cx43 em VEs, bem como da quantidade de Cx43 no núcleo, sugerindo que as funções não canónicas da Cx43, para além da comunicação intercelular mediada por JC, estão comprometidas em condições patológicas. Em suma, os resultados apresentados nesta tese contribuem para uma melhor compreensão do papel da Cx43 no coração, dependente ou não da função de canal, juntamente com a identificação dos interactores que regulam algumas dessas funções. Estes resultados trazem assim novas perspectivas para o desenho de estratégias diagnósticas e terapêuticas inovadoras para as doenças cardiovasculares.