Characterisation of glycoproteins involved in sea urchin adhesion

Abstract

A bioadesão tem sido descrita como essencial para os organismos marinhos pois é através da produção de secreções adesivas que estes se fixam, movem e alimentam nos seus habitats (Flammang et al. 2016). Atualmente, os adesivos mais estudados são os classificados como permanentes (mexilhão, cracas) ou transitórios (caracóis marinhos). Ainda não se conhece muito sobre os adesivos reversíveis (ouriços e estrelas do mar). Numa publicação recente, o nosso laboratório caracterizou a fração glicídica dos adesivos dos ouriços do mar. Simão et al. (2020) analisaram os órgãos adesivos (denominados pés ambulacrários - compostos por um disco adesivo e um caule não-adesivo) e o adesivo secretado, recorrendo a uma bateria de 22 lectinas que reconhecem diferentes glícidos. Os autores detetaram glicoproteínas com resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNac) na epiderme adesiva e no adesivo de Paracentrotus lividus. Este glícido foi identificado na sua forma mais simples (detetado por GSL II) e num arranjo específico (um dímero de glucosamina; detetado por WGA, STL e LEL). A imunomarcação com a LEL mostrou ser a mais específica, marcando estruturas semelhantes a grânulos secretores, empacotados nos ductos das células adesivas até à cutícula do disco.O principal objetivo deste projeto foi caracterizar as potenciais glicoproteínas adesivas/coesivas através da (i) utilização de lectinas para obter diferentes frações enriquecidas com base na especificidade das mesmas para diferentes glícidos; (ii) identificação por espectrometria de massa das glicoproteínas obtidas em cada fração, tirando partido da existência de uma transcriptoma específico para os órgãos adesivos de P. lividus e (iii) seleção dentro das proteínas identificadas, daquelas que apontadas anteriormente como potenciais proteínas adesivas, de forma a realizar uma caracterização bioquímica mais aprofundada das mesmas como base numa análise in sílico utilizando ferramentas bioinformáticas. Esta abordagem multidisciplinar permitiu obter glicoproteínas com elevado peso molecular, com resíduos de GlcNac (simples e em quitobiose) e GalNac. Destas, foi possível identificar e caracterizar cinco proteínas potencialmente adesivas/coesivas, que com base nas suas características bioquímicas podem ser separadas da seguinte forma: (i) duas proteínas grandes carregadas negativamente (Nectina e alfa-tectorina) e uma proteína pequena carregada positivamente (proteína não caracterizada), possivelmente com funções adesivas/coesivas (ii) a enzima alfa-macroglobulina, com uma possível função adesiva/coesiva ou de proteção do adesivo; e (iii) uma peroxidase, muito provavelmente envolvida na polimerização das proteínas do adesivo, contribuindo assim para a sua elevada coesão e insolubilidade.Este estudo permitiu caracterizar em maior profundidade glicoproteínas potencialmente adesivas/coesivas, dando mais um passo para o futuro desenvolvimento de adesivos mais fortes e biocompatíveis inspirados em ouriços do mar.

Bioadhesion is vital for many aquatic organisms, since it is through the production of adhesive secretions that these animals attach, move and feed in their habitats (Flammang et al. 2016). Currently, the best studied bioadhesives are from organisms that attach permanently (mussels, barnacles) or transitorily (limpets), while little is still known about reversible adhesion (sea urchins, sea stars). In a recent publication, our lab focused on the characterization of the glycidic fraction of sea urchin adhesives. Simão et al. (2020) analysed the adhesive organs (so-called tube feet, composed by an adhesive disc and a non-adhesive motile stem) and the secreted adhesive (footprint) using a battery of 22 lectins that recognize different glycans. The authors demonstrated the presence of glycoproteins with N-acetylgalactosamine (GalNac, detected by SBA) and N-acetylglucosamine (GlcNac) residues in Paracentrotus lividus adhesive disc epidermis and footprint, the later either in its simpler form (detected by GSL II) or in a specific chitobiose arrangement (a dimer of -1,4-linked glucosamine units; detected by WGA, STL and LEL). LEL staining was particularly interesting, since it labelled what seems to be secretory granules, packed within the ducts of adhesive cells up to the level of the disc cuticle.The aim of this project was to further investigate these P. lividus candidate adhesive/cohesive glycoproteins through (i) lectin pulldowns, taking advantage of their specificities for different glycans; (ii) identification of the pulled-down glycoproteins by mass-spectrometry, making use of the recently published transcriptome specific for P. lividus adhesive organs and (iii) select within the identified glycoproteins those that were previously pinpointed as putative adhesive candidates and perform an in silico analysis using bioinformatic tools to obtain a more detailed biochemical characterization.Using this multidisciplinary approach, we pulled down high molecular weight glycoproteins containing GlcNac (simple and chitobiose) and GalNac (SBA). Within these, we identified and characterized five candidate adhesive/cohesive glycoproteins, that according to their biochemical characteristics can be separated as follows: (i) two large negatively charge proteins (Nectin and alpha-tectorin) and a smaller positively charge protein (uncharacterized protein), with a probable adhesive and/or cohesive function, (ii) a alpha-2-macroglobulin enzyme, possibly promoting adhesion/cohesion or having a protective role and (iii) a peroxidase, most likely involved in protein crosslinking, contributing to the cohesiveness of the secreted adhesive.By providing a deeper characterization of these adhesive/cohesive glycoproteins, this work gives a step forward towards the development of stronger and biocompatible sea urchin-inspired bioadhesives.