Role of damaged lysosomes on endothelial cells during heart failure with preserved ejection fraction development

Abstract

A insuficiência cardíaca (IC) é uma condição frequente em países desenvolvidos, sendo a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) responsável por mais de 50% dos casos de IC. A ICFEP é caracterizada por uma reduzida capacidade do ventrículo esquerdo em encher-se de sangue devido a uma disfunção diastólica. Apesar da alta incidência desta doença, os mecanismos subjacentes não estão ainda bem caracterizados. Sabe-se que a patogénese da ICFEP está dependente de um estado pró-inflamatório induzido por comorbilidades associadas à doença, como a hipertensão, a diabetes e a obesidade. Uma das citocinas pró-inflamatórias mais importantes na ICFEP é o TNF-α. Esta citocina aumenta a produção de espécies reativas de oxigénio nas células endoteliais (CEs), o que leva à sua disfunção, interferindo com a comunicação intercelular entre CEs e os cardiomiócitos (CMs). Em última análise, esta disfunção na comunicação pode levar à hipertrofia dos CMs. Estudos anteriores mostraram que, em hepatócitos, o TNF-α afeta a atividade dos lisossomas através da permeabilização da membrana lisossomal. Considerando a relação entre o TNF-α em circulação e a disfunção endotelial, assim como a falta de conhecimento sobre o mecanismo de ação subjacente, o nosso estudo teve como objetivo investigar o efeito do TNF-α na função lisossomal, uma das vias mais afetadas em pacientes com ICFEP, usando células endoteliais de veia umbilical humana (CEVUH). Os nossos resultados mostraram que, após a incubação com TNF-α, houve um aumento no tamanho e número de lisossomas, não se tendo observado diferenças na expressão de LAMP1. Demonstrámos também que os níveis de expressão de catepsinas aumentaram, no entanto, a taxa de conversão em catepsinas maturas diminuiu. Contrariamente ao esperado, o TNF-α alterou o pH lisossomal, modificando deste modo a heterogeneidade da população lisossomal. Além disso, observámos que os lisossomas aumentados, resultante da exposição a TNF-α, apresentavam marcadores de dano na membrana lisossomal. Esta citocina pró-inflamatória comprometeu os mecanismos de reparação da membrana lisossomal ao diminuir a expressão de proteínas relevantes como o Tsg101 e a Alix. É importante referir que um aumento no recrutamento de galectina 3 e LC3-II para a membrana do lisossoma também foi observado, sugerindo um aumento na lisofagia. Adicionalmente, a presença do TNF-α também pareceu desencadear a eliminação de lisossomas danificados, através de processos como a autofagia e a exocitose. Com a inibição da autofagia, foi encontrado um aumento na exocitose dos lisossomas danificados, sugerindo que esse mecanismo pode ser um processo alternativo à lisofagia. Por último, os nossos resultados revelaram ainda um novo papel não canónico para a Cx43 na homeostase lisossomal. Apresentámos também que a Cx43 é recrutada para membranas endolisossomais positivas para LAMP1, bem como para vesículas danificadas, galectina 3 positivas. Os nossos resultados demonstraram que a Cx43 pode modular a exocitose lisossomal induzida pelo TNF-α em CEs. No geral, o nosso trabalho revela novos dados sobre a disfunção endotelial mediada por inflamação, associando um papel fundamental aos lisossomas danificados e à sua secreção. Concluindo, revelámos um novo papel não canónico da Cx43 na manutenção da homeostase lisossomal.

Heart failure (HF) is a highly prevalent condition in developed countries with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF), accounting for more than 50% of all cases of HF cases. HFpEF is characterized by a reduced ability of the left ventricle to fill with blood due to a diastolic dysfunction. Although the high incidence of this disease, the underlying mechanisms are not well established. It is known that HFpEF pathogenesis is dependent on a systemic and proinflammatory state, induced by HFpEF-associated comorbidities, such as hypertension, diabetes, and obesity. One of most important proinflammatory cytokines increased in HFpEF is TNF-α. This cytokine increases the production of reactive oxygen species (ROS) in endothelial cells (ECs), leading to their dysfunction and culminating with the disruption of EC-cardiomyocyte intercellular communication. This event ultimately leads to cardiomyocyte hypertrophy. Furthermore, previous studies have shown that in hepatocytes, TNF-α affects lysosomal activity by inducing lysosomal membrane permeability. Considering the connection between circulating TNF-α and endothelial dysfunction and the lack of knowledge on the underlying mechanism of action, we aimed to investigate the effect of TNF-α on the lysosomal function, one of the most affected pathways in HFpEF patients, by using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Our results showed that upon TNF-α stimulation, there was an increase of lysosome size and number, with no observed differences on LAMP1 expression. Additionally, we demonstrated that cathepsins expression levels were increased, however the maturation rate was decreased. Unexpectedly, TNF-α altered the lysosomal pH affecting the heterogeneity of lysosomal population. Moreover, we observed that TNF-α-induced enlarged lysosomes show membrane damage markers. This proinflammatory cytokine compromised membrane repair mechanisms by decreasing the expression of important proteins, Tsg101 and Alix. Importantly, an increase in galectin 3 and LC3-II recruitment to lysosome membrane was found, suggesting an increase in lysophagy. Additionally, TNF-α incubation also seemed to trigger the clearance of damaged lysosomes, by autophagy and exocytosis. Upon autophagy inhibition, an increase in exocytosis of damaged lysosomes was found, suggesting that this mechanism might be an alternative process to lysophagy. Lastly, our findings disclosed a new non-canonical role for Cx43 on lysosomal homeostasis. We found that Cx43 is recruited to LAMP1 positive endolysosomal membranes as well as to galectin-3 positive damaged vesicles. Our results also demonstrated that Cx43 can modulate lysosomal exocytosis induced by TNF-α in ECs. Overall, our data unveil new insights on inflammation-mediated endothelial dysfunction, by giving a pivotal role to damaged lysosomes and their secretion. In addition, a new non-canonical role of Cx43 in the alleviation of the lysosomal burden was unveiled.