Relatórios de Estágio e Monografia intitulada "Edição de Bases: o futuro da edição de genes?

Abstract

By taking advantage of the CRISPR-Cas9 system, gene editing is able to correct a gene mutation through replacement of the mutated portion with an exogenous DNA. However, the first step for this correction is to generate double-stranded DNA breaks. This process is associated with a high prevalence of unwanted products, because cellular DNA repair will introduce in high rates small insertions or deletions, called indels. On the other hand, most human genetic diseases are caused by point mutations in a single nucleotide. Therefore, the interest in developing a technique that only changes the mutant allele and that is not associated with a high rate of indels arised.Thus, base editing was developed. This technique is able to convert, in a programmable manner, one base into another, without the need to introduce the double-stranded DNA breaks. Using the CRISPR system, associated with catalytically deactivated Cas9 variants and deaminases, two types of base editors were created – cytosine base editors and adenine base editors – which, together, can perform the following transitions: C→T, G→A, T→C and A→G. Currently, there are several versions of both editors as a result of successive optimizations in order to improve the efficiency and the final product purity. Likewise, the delivery strategies to the cells needs to be tailored, once the size of the base editors is larger than the load capacity of most known vectors. One of the strategies is to split the base editor and deliver each half to the cell into two different AAV vectors, where the full-length base editor is then reconstituted within the target cell. Nevertheless, other methods have also been used, such as non-viral vectors, through electroporation or transport through lipids.Despite the many hurdles that are yet to be overcome, base editing is a very versatile technique, which has been used in both study of several genetic pathologies and potential treatments. This can be achieved through the introduction of STOP codons, changes in the initiation codon or correction of nonsense mutations, among others. Therefore, the results indicate that we are in the right path towards future successful application of gene editing.

A edição de genes, com recurso ao sistema CRISPR-Cas9, é capaz de corrigir uma mutação num gene, através da substituição da porção mutada por uma sequência de DNA exógeno. No entanto, o primeiro passo para esta correção é o corte da dupla cadeia de DNA. Este fenómeno está associado a uma elevada prevalência de produtos indesejados, uma vez que estes, devido aos processos de reparação celular do DNA, vão conter pequenas inserções e deleções, denominadas de indels. Por outro lado, a maioria das doenças genéticas humanas são causadas por mutações pontuais num único nucleótido. Consequentemente, emergiu o interesse pelo desenvolvimento de uma técnica que apenas alterasse o alelo mutante e à qual não estivessem associadas elevadas taxas de indels. Surgiu, então, a edição de bases. Esta técnica é capaz de converter, de forma programada, um nucleótido noutro, sem a necessidade de cortar a dupla cadeia de DNA. Recorrendo ao sistema CRISPR, associado a variantes da Cas9 cataliticamente desativadas e a desaminases, foram desenvolvidos dois tipos de editores de bases – editores de bases citosina e editores de bases adenina – que, em conjunto, permitem realizar as seguintes transições: C→T, G→A, T→C e A→G. Atualmente, existem diversas versões de ambos os editores, resultado de sucessivas otimizações com o intuito de melhorar a eficácia e a pureza do produto obtido. Do mesmo modo, as estratégias de entrega às células têm de ser adaptadas, uma vez que o tamanho dos editores de bases é superior à capacidade de carga dos vetores convencionais. Uma das estratégias passa por dividir o editor e entregá-lo à célula em dois vetores AAV distintos, sendo posteriormente reconstituído dentro da célula alvo. No entanto, outros métodos também têm sido utilizados, tais como os vetores não virais, através de eletroporação ou transporte mediado por lípidos.Apesar de esta técnica acarretar, ainda, muitos obstáculos que têm de ser ultrapassados, a edição de bases é uma técnica bastante versátil, que tem sido utilizada no estudo de diversas patologias genéticas e seu potencial tratamento. Tal, pode ser conseguido através da introdução de codões STOP, de mutações no codão de iniciação ou da correção de mutações nonsense, entre outros. Consequentemente, perante os resultados obtidos, pode afirmar-se que estamos a caminho do domínio de uma tecnologia revolucionária, que se espera que venha a permitir manipular o genoma com grande precisão e, assim, tratar ou curar múltiplas doenças.