Elucidating autoprocessing activity and function of the rickettsial retropepsin APRc in mammalian cells

Abstract

As espécies do género Rickettsia são bactérias intracelulares obrigatórias transmitidas a mamíferos através de vetores artrópodes, causando doenças infeciosas, como a febre maculosa das Montanhas Rochosas, a febre escaro-nodular e o tifo epidémico. A elevada patogenicidade e a falta de terapêuticas eficazes, associadas ao progressivo aumento da resistência a antibióticos, reforçam a importância da pesquisa de novos fatores de Rickettsia para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Neste contexto, a protease aspártica de Rickettsia conorii (APRc) emerge como um potencial alvo, tendo sido demonstrado que catalisa o processamento in vitro de duas proteínas autotransportadoras envolvidas na adesão e invasão de Rickettsia (Sca5/OmpB e Sca0/OmpA), antecipando o seu potencial envolvimento na modulação de fatores de virulência de Rickettsia. A APRc é uma protease membranar do tipo retropepsina, partilhando várias características com esta família de proteases aspárticas. Estas evidências experimentais marcam o início do estudo da APRc como um potencial alvo terapêutico em rickettsioses. No entanto, ainda existem várias questões em aberto relativamente à relação estrutura-função, sobretudo relativamente ao mecanismo e à dinâmica da atividade autolítica da APRc, bem como da natureza dos seus substratos. Até ao momento, a atividade de autoprocessamento da APRc apenas foi estudada in vitro e em E. coli. No entanto, e dada a relevância de células de mamífero na infeção por Rickettsia, importa avaliar a atividade da APRc também neste contexto. Neste trabalho, demonstrámos que diferentes construções do domínio solúvel da protease são autoprocessadas após expressão transiente em células HEK293, sendo este processo dependente da atividade catalítica da APRc. Além disso, a expressão de APRc induziu alterações morfológicas, como condensação nuclear, alteração da forma nuclear e aparecimento de material celular fragmentado, também dependente da sua atividade catalítica. Estas características são geralmente observadas em células apoptóticas e ensaios adicionais parecem corroborar este fenótipo de apoptose, observando-se um aumento na percentagem de células positivas para caspase-3 clivada e PARP clivada, e na percentagem de células anexina V-APC+/DAPI-, após a expressão da APRc. Com este trabalho demonstramos o autoprocessamento da APRc em células HEK293 e antecipamos uma nova putativa função biológica desta protease de Rickettsia na modulação de processos de morte celular.

Rickettsia species are obligate intracellular bacteria that are transmitted to mammals through arthropod vectors, causing infectious diseases, such as Rocky Mountain spotted fever, Mediterranean spotted fever, and epidemic typhus. The life-threatening character of rickettsioses, the lack of specific therapeutics, and the progressive increase in antimicrobial resistance due to inappropriate use of antibiotics reinforces the importance of searching for new rickettsial factors to develop innovative therapeutic strategies. In this context, the aspartic protease from Rickettsia conorii (APRc) emerges as a candidate target for intervention since it was shown that this enzyme is able to catalyze the in vitro processing of two autotransporter adhesin/invasion proteins, Sca5/OmpB and Sca0/OmpA, anticipating its potential participation as a modulator of rickettsial surface virulence factors. APRc is a membrane-embedded retropepsin-like homologue, sharing several features of this family of aspartic proteases. This experimental evidence marks the beginning of exploring APRc as a target for developing new strategies to combat rickettsioses. However, there are still several open questions regarding structure-function relationships of APRc, namely in what concerns the mechanisms and dynamics of its autoactivation/activity and the nature of its substrates, which would help us to infer the functional relevance of this protease during infection. Until now, the autoprocessing activity of APRc was only studied in vitro and E. coli. However, the relevance of mammalian cells in rickettsial infection supports extending research to explore APRc activity in this context. Herein, we demonstrate that different GFP-APRc fusion constructs undergo autoprocessing upon transient expression in HEK293 cells, and that this process is dependent on the catalytic aspartate. Moreover, the expression of the different forms of APRc induced morphological alterations, such as nuclear condensation, alterations of nuclear shape, and the presence of fragmented cellular material, again dependent on APRc proteolytic activity. These features resemble an apoptotic phenotype, which our additional assays appear to corroborate by showing an increase in nuclear condensation, on the percentage of cleaved caspase-3 and cleaved PARP-positive cells, and of annexin V-APC+/DAPI- cells, upon expression of APRc. Taken together, the evidence presented in this work confirms APRc autoprocessing in HEK293 cells and suggest that induction of cell death may be one of the putative functions of this highly conserved rickettsial protease.