Role of lysine deacetylases on transcription regulation and mitochondrial function in Huntington's disease

Abstract

Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder that gradually affects memory, cognitive skills and normal movements of the affected individuals and for which no disease modifying treatments exist. The disease is caused by an expanded CAG trinucleotide repeat (of variable length) in the HTT gene that encodes the huntingtin protein (HTT). Mutant HTT (mHTT) exhibits an abnormal elongated polyglutamine stretch that confers a toxic gain of function and predisposes the protein to fragmentation and aggregation, resulting in neuronal dysfunction and selective death in striatum and cortex. There is strong evidence that transcriptional deregulation and altered mitochondrial function occurs early and acts causally in HD pathogenesis; importantly, these events may be related to altered acetylation of proteins. Therefore, pharmacological strategies that interfere with both nuclear and mitochondrial protein acetylation may be therapeutically useful to hinder neuronal dysfunction in the course of HD pathology. In the present work, distinct lysine deacetylases (a heterogeneous group of proteins that remove acetyl groups from histones and other proteins regulating their structure and function), were pharmacologically or genetically targeted with the main purpose of counteracting mitochondrial and metabolic deficits in in vitro and in vivo models expressing human full-length mHTT. We have previously shown that mitochondrial dysfunction in HD persists at the level of pyruvate dehydrogenase (PDH), which functionally links glycolysis to oxidative phosphorylation. In Chapter 3 we report that decreased PDH activity in HD striatal cells expressing 111 glutamines (STHdhQ111/Q111) occurs through enhanced PDH kinases (PDKs) and reduced PDH phosphatase 1 protein expression, which trigger inhibitory phosphorylation of catalytic PDH E1α subunit in three different serine sites (Ser293, Ser300 and Ser232). Classes I and IIa histone deacetylase inhibitors (HDACi), sodium butyrate (SB) and phenylbutyrate, increased histone H3 acetylation and enhanced metabolism and mitochondrial respiration, similar to PDH activator dichloroacetate, suggesting that HDACi may favor activation of PDH complex. Concordantly, SB significantly decreased the expression of PDK2 and PDK3 in STHdhQ111/Q111 cells, which led to decreased PDH E1α phosphorylation in all serine sites. This effect occurs since HDACi SB stimulates HIF-1α degradation, a transcription factor that actively suppresses metabolism by directly transactivating genes encoding for PDKs. Therefore, partial depletion of PDK3 enhanced mitochondrial respiration and ATP synthesis in both wild-type and mutant STHdh cells, similarly to the effects achieved with SB treatment. YAC128 transgenic HD mice also exhibited decreased PDH E1α phosphorylation and PDK1-3 expression after SB treatment, which positively influenced central and peripheral metabolism. Further studies were conducted using modulators of class III lysine deacetylases, classically known as sirtuins. SIRT1, the best studied member of the sirtuins family, has been shown to exert neuroprotective roles in several models of neurodegeneration, boosting the interest in the development of SIRT1 activators. However, recent reports on SIRT1 inhibitors have also shown protective effects, casting doubt regarding previous findings. To better understand this paradox we tested resveratrol (RESV, a SIRT1 activator) and nicotinamide (NAM, a SIRT1 inhibitor) in in vitro models and in an animal model expressing mHTT (Chapter 4). We found that RESV enhanced lysine deacetylation activity and recovered abnormal mitochondrial phenotype of lymphoblasts from affected HD patients and cortical and striatal primary neurons isolated from YAC128 mice, which was associated with increased mitochondrial transcription and biogenesis. NAM had no effects on mitochondrial biogenesis, however increased NAD+ levels following NAM treatment may explain the positive impact on mitochondrial function in vitro. In symptomatic YAC128 mice, RESV completely abrogated deficits in motor learning and coordination, two well-established features of this transgenic HD model, and increased transcription of mitochondrial-encoded electron transport chain genes. In turn, NAM supplementation in vivo proved to be deleterious. The positive effects achieved with the SIRT-activating compound RESV led us to specifically target SIRT3 (Chapter 5), the major mitochondrial deacetylase that has received much attention for its role in oxidative metabolism and aging. We found increased SIRT3 levels and activity in HD lymphoblasts and in STHdhQ111/Q111 cells. Considering its potential neuroprotective role in HD, we overexpressed (OE) SIRT3, which was shown to co-localize more in mitochondria from HD striatal cells than in wild-type counterparts. Cortical tissue from YAC128 mice also exhibited lower acetylation of superoxide dismutase 2, a recognized target of SIRT3, suggesting increased SIRT3 activity. When OE in STHdh, SIRT3 enhanced lysine deacetylation and mitochondrial transmembrane potential. SIRT3 OE also reverted the loss in mitochondrial-related transcription factors, PGC-1α and TFAM, induced by mHTT. Still, increased mitochondrial content was not observed. Ultimately, STHdhQ111/Q111-SIRT3 OE cells showed lower susceptibility to apoptotic cell death. Overall, this study provides novel insights into the molecular deficits underlying mitochondrial dysfunction in HD and explores promising drugs that effectively modulate acetylation landscape, further impacting on mitochondrial and mitochondrial-related transcription proteins activity. Finally, increased mitochondrial activity and transcription partially control HD-related motor disturbances and neuronal death.

A Doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa que afeta gradualmente as capacidade cognitivas e motoras dos indivíduos afetados, e para a qual não existe tratamento neuroprotetor ou cura. A DH é causada por uma expansão de trinucleótidos CAG (de tamanho variável) no gene HTT que codifica para a proteína huntingtina (HTT). A HTT mutante (mHTT) possui uma expansão anormal de poliglutaminas que lhe confere uma função tóxica, predispondo-a para a fragmentação e agregação, resultando em disfunção e morte seletiva de neurónios estriatais e corticais. Fortes evidências sugerem que alterações na regulação da transcrição e na função mitocondrial ocorrem em estádios iniciais da doença e são fatores causais para a patogénese da DH; estes eventos poderão estar relacionados com alterações na acetilação de proteínas. Assim, estratégias farmacológicas que interfiram com a acetilação de proteínas nucleares e mitocondriais poderão ser profícuas no combate à disfunção neuronal no decurso da DH. Neste trabalho diferentes desacetilases de lisinas (um grupo heterogéneo de proteínas que remove grupos acetil de histonas ou outras proteínas, regulando a sua estrutura e função) foram farmacologicamente ou geneticamente moduladas com o objetivo de neutralizar os défices mitocondriais e metabólicos em modelos que expressam a mHTT. Anteriormente o nosso grupo de investigação mostrou que a disfunção mitocondrial ocorre ao nível da piruvato desidrogenase (PDH), um complexo enzimático que faz a ligação entre a glicólise e a fosforilação oxidativa. No Capítulo 3 desta tese mostrámos que a diminuição da atividade da PDH em células estriatais que expressam 111 glutaminas (STHdhQ111/Q111) ocorre devido ao aumento das cinases da PDH (PDKs) e à diminuição da fosfatase 1 da PDH, desencadeando a fosforilação (inibitória) da subunidade catalítica PDH E1α em três resíduos de serina (Ser293, Ser300 e Ser232). Inibidores das classes I e IIa das desacetilases de histonas (HDACi), os compostos butirato de sódio (BS) e fenilbutirato, aumentaram a acetilação da histona H3 e melhoraram o metabolismo e a respiração mitocondrial, de forma semelhante ao observado com dicloroacetato, um reconhecido ativador da PDH, sugerindo que os HDACi poderão favorecer a atividade da PDH. Em concordância, o SB diminuiu a expressão da PDK2 e PDK3 nas células STHdhQ111/Q111, o que levou a uma diminuição da fosforilação da PDH E1α em todos os resíduos de serina. Este efeito mediado pelo SB parece ter resultado da estimulação da degradação do HIF-1α, um fator de transcrição que inibe o metabolismo celular através da transativação de genes que codificam para as PDKs. De forma semelhante ao SB, a redução parcial da expressão da PDK3 aumentou a respiração mitocondrial e a síntese de ATP em ambas as células STHdh wild-type e mutante. No murganho transgénico YAC128 verificou-se uma diminuição na fosforilação da PDH E1α e na expressão das PDK1-3 após tratamento com SB, influenciando positivamente o metabolismo energético. Nos estudos que se seguiram foram utilizados moduladores de desacetilases de lisinas de classe III, conhecidas como sirtuinas. A SIRT1, o membro da família mais estudado, tem vindo a mostrar um papel neuroprotetor em vários modelos de neurodegenerescência, aumentando o interesse no desenvolvimento de ativadores da SIRT1. No entanto, em estudos mais recentes os inibidores da SIRT1 também mostraram resultados protetores, colocando em dúvida as observações anteriores. Para compreender melhor este paradoxo, testámos o efeito do resveratrol (RESV, ativador da SIRT1) e da nicotinamida (NAM, inibidor da SIRT1) em modelos in vitro e num animal modelo que expressa a mHTT (Capítulo 4). O RESV aumentou a atividade desacetilase e reverteu a disfunção mitocondrial quando testado em linfoblastos de doentes de Huntington e em neurónios corticais e estriatais isolados de embriões do murganho YAC128; estas observações foram associadas ao aumento da transcrição e biogénese mitocondrial. O tratamento com NAM não teve qualquer efeito na biogénese mitocondrial; no entanto, o aumento dos níveis de NAD+ poderão justificar o impacto positivo observado na função mitocondrial testada in vitro. Quando administrado numa fase sintomática do murganho YAC128, o RESV anulou os défices de aprendizagem e coordenação motora, duas características deste animal transgénico, e aumentou a transcrição de genes da cadeia respiratória mitocondrial codificados pelo DNA mitocondrial. Por sua vez, a administração de NAM teve um efeito deletério in vivo. Os efeitos positivos obtidos com o ativador da SIRT1, resveratrol, levou-nos a modular especificamente a SIRT3 (Capítulo 5), uma desacetilase mitocondrial que tem recebido especial atenção pelo seu papel no metabolismo oxidativo e no processo de envelhecimento. Em linfoblastos DH e em células STHdhQ111/Q111 observámos um aumento dos níveis proteícos, de RNAm e da atividade da SIRT3. Considerando o potencial terapêutico da SIRT3 na DH, sobre-expressámos (SE) esta proteína em células estriatais e verificámos que se co-localiza preferencialmente nas mitocôndrias das células estriatais mutantes, comparativamente às células wild-type. O córtex do murganho YAC128 também exibiu menor acetilação da proteína superóxido dismutase 2, um alvo da SIRT3, sugerindo uma maior atividade desta sirtuína no contexto da DH. Quando SE em células STHdh, a SIRT3 aumentou a desacetilação e o potencial de membrana mitocondrial. A SE da SIRT3 também reverteu a diminuição dos fatores de transcrição associados à mitocôndria, PGC-1α e TFAM, induzida pela mHtt. Contudo, não se observou um aumento da massa mitocondrial. Por fim, as células STHdhQ111/Q111 que com SIRT3 SE apresentaram uma menor suscetibilidade à morte celular por apoptose. Em conclusão, este estudo fornece novas perspetivas sobre os défices moleculares subjacentes à disfunção mitocondrial na DH, e explora estratégias farmacológicas promissoras que modificam a acetilação e que têm posterior impacto na atividade da mitocôndria e nos fatores de transcrição associados a este organelo. Adicionalmente, o aumento da função e transcrição mitocondrial influenciam os distúrbios motores e a morte neuronal associada à DH. Palavras chave: Doença de Huntington, mitocôndria, piruvato desidrogenase, desacetilases de lisinas, neuroproteção.