NMR Analysis of urinary acetaminophen-glucuronide enrichments from 2H and 13C metabolic tracers in mouse models.

Abstract

A sociedade contemporânea está repleta de casos de obesidade e diabetes tipo 2, com maior incidência em países desenvolvidos, e a previsão para os próximos anos/décadas não é brilhante. Um dos principais componentes desta epidemia é o consumo de frutose que excede a base evolutiva em que os seres humanos estão inseridos, resultado no metabolismo desequilibrado de hidratos de carbono e lípidos.Aqui propomo-nos a estudar o impacto da frutose no metabolismo hepático, utilizando ratinhos C57BL/6, que são suscetíveis à obesidade induzida pela dieta e diabetes tipo 2. A abordagem baseia-se na utilização da marcação de isótopos estáveis, nomeadamente 2H (que permite o estudo dos fluxos metabólicos de todos os precursores de nutrientes) e 13C (para estudar o destino específico dos carbonos da glucose e da frutose, com base no perfil de marcação de isotopómeros).Este estudo foi realizado através da administração de paracetamol que se ligará ao precursor imediato do glicogénio (UDPG, glucose difosfato de uridina) via ligação glicosídica, originando um glucuronato (glucuronato-paracetamol). O glucuronato-paracetamol é excretado na urina como parte de um processo de destoxificação que ocorre no fígado, proporcionando um método de biópsia não invasiva que permite o estudo das vias metabólicas hepáticas.Para a análise de RMN do glucuronato-paracetamol, o processo mais comumente utilizado é a derivatização para MAGL (Lactona Glucurónica Monoacetonada). Como o foco deste estudo será em ratinhos e o protocolo de derivatização tem rendimentos reduzidos (rendimento aproximado de 30-50%), ele iria causar perdas significativas de material durante o processo de derivatização, invalidando a capacidade de progredir no estudo. Para resolver este problema, propomos também desenvolver e aperfeiçoar um processo de purificação com maior eficiência, nomeadamente utilizando colunas de SPE (rendimento aproximado de 80-92%).

Contemporary society abounds with cases of obesity and type 2 diabetes, with more incidence in developed countries, and the forecast for the upcoming years/decades is not bright. One of the key components of this epidemic is the consumption of fructose that exceeds the evolutionary basis in which humans exist, resulting in the unbalanced metabolism of carbohydrates and lipids.Here we propose to study the impact that fructose has on hepatic metabolism, using C57BL/6 mice: a strain that is susceptible to diet-induced obesity and type 2 diabetes. The approach is based on the use of stable isotope labelling, namely 2H (that allows metabolic fluxes from all nutrient precursors to be studied) and 13C (in order to study the specific destiny of the carbons of glucose and fructose, based on the isotopomer labelling profile).This study was realized by administrating acetaminophen (commonly known as paracetamol) that binds to the immediate precursor of glycogen (UDPG, uridine diphosphate glucose) via glycosidic bond, originating a glucuronide (AG, acetaminophen-glucuronide). AG is excreted in the urine as a part of a detoxification process that occurs in the liver, providing a non-invasive biopsy that allows the study of hepatic metabolic pathways.For NMR analysis of the AG, the most commonly used process is the derivatization to MAGL (Monoacetone Glucuronic Lactone). Because the focus of this study will be on mice and the derivatization protocol is characterized by having low yields (approximate yield 30-50%), it would cause significant material loses during the derivatization process, invalidating the ability to progress in the study. To solve this problem we also propose developing and perfecting a purification process with a higher efficiency, namely using SPE-columns process (approximate yield 80-92%).