Impact of nucleolin downregulation on cellular features of Triple Negative Breast Cancer cells

Abstract

Cancer incidence is increasing and became one of the leading causes of death and morbidity worldwide. Breast cancer is the most diagnosed type of cancer and the leading cause of death among women. Cancer cells accumulate genetic alterations, which above a certain threshold, determine malignancy, characterized by uncontrolled growth and limitless replication, invasion and metastases. Basal-like breast cancers (commonly referred as Triple Negative Breast Cancers, TNBC) are heterogenous in both molecular and clinical aspects. They are characterized by the absence of positivity for oestrogen receptor (ER), human epidermal growth factor receptor 2 (Erb-B2) and progesterone receptor (PR), high tumour aggressiveness and poor prognosis and outcome. Cancer stem cells (CSC) are argued as responsible for sustaining malignant growth as they are able to self-renew, to differentiate into every cell type within the tumour, and to resist to conventional anticancer therapies, thus increasing the risk of relapse. Understanding the biology of CSC and developing targeting strategies against these cells is therefore highly relevant. Stemness status has been correlated with the expression of nucleolin, which is a highly conserved nucleolar phosphoprotein exhibiting known functions on ribosome biogenesis, gene transcription and translation, thus with impact on cell cycle, cell proliferation and cell fate (survival vs death). All these functions may involve the regulation of stemness. Nucleolin is overexpressed in a variety of tumours, including breast, and has been implicated in several aspects of tumorigenesis, which is why it has emerged as a marker for targeted anticancer therapies. Nevertheless, it is yet to be determined the specific role of nucleolin in the tumorigenic complex and dynamic process. The present work aims to dissect and clarify the role of nucleolin in breast cancer cells proliferation and metastization. For that purpose, TNBC cells, namely MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cell lines, with stable downregulation of nucleolin were generated and assessed for their cell cycle distribution, cell proliferation, migration and stemness, relative to control. In fact, downregulation of nucleolin reduced migration, altered cell division and cell cycle distribution and impaired mammosphere formation. Additionally, morphological changes towards a senescent phenotype were observed. The present observations support that overexpressed nucleolin in TNBC cells is relevant for an aggressive phenotype characterized by increased migration, proliferation and stemness.

A incidência de cancro tem vindo a aumentar e tornou-se uma das principais causas de morte e morbidade em todo o mundo. O cancro da mama é o tipo de cancro mais diagnosticado e a principal causa de morte entre as mulheres.As células cancerígenas acumulam alterações genéticas, que acima de um certo limiar, determinam malignidade, caracterizada por crescimento descontrolado e capacidade replicativa ilimitada, invasão e metástase. Os cancros da mama do tipo basal-like (habitualmente referidos como cancros da mama triplo negativos) são heterogéneos tanto do ponto de vista molecular como clínico. São caracterizados pela ausência do recetor de estrogénio (ER), do recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (Erb-B2) e do recetor de progesterona (PR), pela alta agressividade e pelo mau prognóstico.As células estaminais cancerígenas são responsáveis por sustentar o crescimento dos tumores, devido à capacidade de se autorrenovarem, se diferenciarem em todos os tipos celulares do tumor e à resistência às terapias antineoplásicas convencionais. Compreender a sua biologia e desenvolver estratégias terapêuticas a elas direcionadas é atualmente o principal foco da investigação em oncologia. A estaminalidade foi já correlacionado com os níveis de nucleolina que se trata de uma fosfoproteína nucleolar altamente conservada com funções conhecidas na biogénese de ribossomas, na transcrição e tradução de genes e no ciclo celular, na proliferação e no destino da célula (sobrevivência vs morte), o que pode estar relacionado com a regulação da estaminalidade. A nucleolina está sobrexpressa em diversos tumores, incluindo da mama, e tem sido implicada na tumorigénese, razão pela qual surgiu como um alvo para terapias antineoplásicas direcionadas. No entanto, é ainda necessário determinar o seu papel específico no processo complexo e dinâmico de tumorigénese.O presente trabalho tem como objetivo dissecar e esclarecer o papel da nucleolina na proliferação e metastização de células de cancro da mama. Para tal, células de cancro da mama triplo negativo, nomeadamente as linhas celulares MDA-MB-231 e MDA-MB-468, com subexpressão estável de nucleolina foram geradas e avaliadas quanto à distribuição do ciclo celular, proliferação, migração e estaminalidade, relativamente ao controlo. De facto, a subexpressão de nucleolina reduziu a migração, alterou a divisão celular e a distribuição do ciclo e prejudicou a formação de mamosferas. Foram também verificadas alterações morfológicas correspondentes a um fenótipo senescente. Estas observações suportam que a sobrexpressão de nucleolina em células de cancro da mama triplo negativo é relevante para um fenótipo agressivo caracterizado por aumento da migração, proliferação e estaminalidade.