The role of neuropeptide Y in articular chondrocyte functions

Abstract

O neuropeptídeo Y (NPY) tem sido sugerido como possível alvo terapêutico em doenças relacionadas ao envelhecimento, devido à sua capacidade de inibir a inflamação e estimular a proliferação, diferenciação e sobrevivência celular. Diferentes estudos mostram seu papel na inibição de citocinas inflamatórias em células do sistema imunológico. Além disso, tem efeitos benéficos na remodelação óssea, promovendo a homeostase celular. No tecido sinovial, esse peptídeo foi detectado em fibras nervosas simpáticas em pacientes com osteoartrite (OA) e estudos recentes mostraram que pacientes com graus avançados de osteoartrite têm níveis elevados do NPY no líquido sinovial e esses níveis se correlacionam com a intensidade de dor, sugerindo um papel para o NPY como um regulador putativo da transmissão e percepção da dor na OA.OA é uma doença que causa danos ao longo dos tecidos articulares e a cartilagem é mais gravemente afetada. As causas da doença não são bem compreendidas; entretanto, aceita-se que a inflamação sinovial pode ser um fator agravante e / ou desencadeante, promovendo alterações nos condrócitos humanos que passam a produzir enzimas que degradam a matriz cartilaginosa. Um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento da OA é o envelhecimento. Devido ao aumento da expectativa de vida em todo o mundo e aos danos causados pela OA, levando à incapacidade e dor, e à falta de terapias modificadoras da doença, os custos socioeconômicos associados são muito altos e continuam aumentando, o que levou a Organização Mundial da Saúde a designar a OA como uma doença prioritária para a qual é urgente encontrar novos alvos terapêuticos e estratégias terapêuticas.Devido ao potencial do NPY em promover a homeostase pela inibição do dano e perda de função celular relacionada ao envelhecimento e aos estudos anteriores em nosso grupo que mostraram a presença de receptores NPY em condrócitos humanos e que o NPY é capaz de reduzir respostas inflamatórias nessas células, nós levantamos a hipótese que poderia ser eficaz em parar o desenvolvimento e / ou progressão da OA. Assim, este estudo tem como objetivo compreender o papel do NPY na OA estudando sua capacidade de modular as funções anabólicas, catabólicas e inflamatórias dos condrócitos humanos.Para isso, foram utilizados condrócitos humanos isolados da cartilagem do joelho de dadores post mortem, coletados no Banco de Tecidos e Ossos da Universidade e Centro Hospitalar de Coimbra. Primeiro, tentamos identificar os subtipos de receptores do NPY que medeiam seus efeitos anti-inflamatórios nos condrócitos humanos. Os resultados obtidos sugerem que os três principais subtipos de receptores do NPY, os receptores Y1, Y2 e Y5, são necessários para mediar as respostas anti-inflamatórias do NPY, no entanto Y5 parece desempenhar um papel mais significativo. Além disso, mostramos que o NPY não modula diretamente a via de ativação do NF-κB para promover a redução da inflamação, mas parece agir indiretamente sobre outras proteínas reguladoras, levando à inibição da atividade transcricional do NF-κB / p65.A matriz extracelular da cartilagem é ativamente remodelada por condrócitos sob condições inflamatórias. Assim, também avaliamos a capacidade do NPY, isoladamente e sob condições inflamatórias, de modular a expressão da Metaloproteinase da Matriz (MMP) -13, que é uma das principais colagenases envolvidas na OA, e do colágeno tipo 2, o principal componente proteico do ECM da cartilagem articular. O NPY não diminuiu os níveis da proteína MMP-13, seja em condições basais ou inflamatórias, mimetizadas pelo tratamento das células com a citocina pró-inflamatória Interleucina-1β (IL-1β). No entanto, diminuiu significativamente os níveis basais do mRNA da MMP-13 e também reduziu o aumento induzido pela IL-1β, embora, neste caso, a diferença não tenha alcançado significância estatística devido à grande variabilidade nos extratos celulares obtidos de diferentes doadores. Por outro lado, descobriu-se que o NPY aumenta significativamente o colágeno tipo 2, tanto os níveis proteicos como do mRNA, assim como também diminuiu significativamente o efeito inibitório da IL-1β, embora a significância estatística tenha sido alcançada apenas para os níveis de proteína MMP-13, sugerindo que o NPY desempenha um importante papel pró-anabólico, seja sob condições basais ou inflamatórias. No entanto, um número maior de amostras terá que ser analisado para determinar mais conclusivamente se o NPY tem efeitos anti-catabólicos e pró-anabólicos em condrócitos humanos.Em resumo, este estudo mostra que o NPY tem efeitos anti-inflamatórios, anti-catabólicos e pró-anabólicos em condrócitos humanos, sugerindo que ele pode desempenhar um papel protetor nas articulações humanas, que são a base para estudos adicionais para determinar a eficácia do NPY e seus receptores como potenciais alvos terapêuticos para OA.

Neuropeptide Y (NPY) has been suggested as a possible therapeutic target in aging-related diseases due to its ability to inhibit inflammation and stimulate cell proliferation, differentiation and survival. Different studies show its role in inhibiting inflammatory cytokines in cells of the immune system. Moreover, it has beneficial effects on bone remodelling, promoting cellular homeostasis. In the synovial tissue, this peptide has been detected in sympathetic nerve fibers in patients with osteoarthritis (OA) and recently studies have shown that patients with advanced degrees of osteoarthritis have high levels of NPY in the synovial fluid and those levels correlated with the intensity of pain, suggesting a role for NPY as a putative regulator of pain transmission and perception in OA.OA is a disease that causes damage throughout the joint tissues and cartilage is the most severely affected. The causes of the disease are not well understood; however, it is accepted that synovial inflammation can be an aggravating and/or initiating factor, promoting changes in the human chondrocytes that begin to produce enzymes that degrade the cartilaginous matrix. One of the major risk factors for OA development is aging. Due to the increase in life expectancy worldwide and the damage caused by OA, leading to disability and pain, and the lack of effective disease-modifying therapies, the associated socio-economic costs are very high and keep increasing which led the World Health Organization to designate OA as a priority disease for which it is urgent to find new therapeutic targets and therapeutic strategies.Due to the potential of NPY to promote homeostasis by inhibiting aging-related cell and tissue damage and loss of function and to previous studies in our group that have shown the presence of NPY receptors on human chondrocytes and that NPY is able to reduce inflammatory responses in these cells, we hypothesised that it may be effective in stopping OA development and/or progression. Thus, this study aims to understand the role of NPY in OA by studying its ability to modulate human chondrocyte anabolic, catabolic and inflammatory functions. For this, we used human chondrocytes isolated from the knee cartilage of cadaver tissue donors, collected at the Bone and Tissue Bank of the University and Hospital Center of Coimbra. First, we tried to identify the NPY receptor subtypes that mediate its anti-inflammatory effects in human chondrocytes. The results obtained suggest that the three main NPY receptor subtypes, Y1, Y2 and Y5 receptors, are required to mediate NPY anti-inflammatory responses, yet Y5 appears to play a more significant role. Furthermore, we have shown that NPY does not directly modulate the NF-κB activation pathway to promote the reduction of inflammation, but appears to act on other regulatory proteins indirectly leading to inhibition of NF-B/p65 transcriptional activity. The cartilage extracellular matrix is actively remodelled by chondrocytes under inflammatory conditions. Thus, we also evaluated the ability of NPY, alone and under inflammatory conditions, to modulate the expression of Matrix Metalloprotease (MMP)-13, which is a major collagenase involved in OA, and of collagen type 2, the major protein component of the articular cartilage ECM. NPY did not decrease the protein levels of MMP-13, either under basal or inflammatory conditions mimicked by treatment of the cell with the pro-inflammatory cytokine, Interleukin-1β (IL-1β). However, it significantly decreased basal MMP-13 mRNA levels and also reduced the increase induced by IL-1β, although in this case, the difference did not reach statistical significance due to the large variability in cell extracts obtained from different donors. On the other hand, NPY was found to significantly increase collagen type 2, both at the mRNA and protein levels, and also to significantly decrease the inhibitory effect of IL-1β, although statistical significance was reached only for MMP-13 protein levels, suggesting that NPY plays an important pro-anabolic role, either under basal or inflammatory conditions. Nonetheless, a larger number of samples will have to be analysed to determine more conclusively whether NPY has anti-catabolic and pro-anabolic effects in human chondrocytes. In summary, this study shows that NPY has anti-inflammatory, anti-catabolic and pro-anabolic effects in human chondrocytes, suggesting that it can play a protective role in human joints which are the basis for additional studies to determine the efficacy of NPY and its receptors as potential therapeutic targets for OA.