Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/89589
Title: Alterations of neuronal K+-Cl- co-transporter KCC2 during status epilepticus: possible impact on GABAergic neurotransmission
Other Titles: Alterações do co-transportador neuronal de K + -Cl- KCC2 durante o status epilepticus: possível impacto na neurotransmissão GABAérgica
Authors: Miarelli, Cinzia
Orientador: Duarte, Carlos Jorge Alves Miranda Bandeira
Mele, Miranda
Keywords: Epilepsia; Estado de mal epiléptico; Homeostase do cloreto; KCC2, co-transportador de K+-Cl-; Inibição GABAérgica; Epilepsy; Status Epilepticus; Chloride homeostasis; K+-Cl- cotransporter KCC2; GABAergic inhibition
Issue Date: 16-Sep-2019
Serial title, monograph or event: Alterations of neuronal K+-Cl- co-transporter KCC2 during status epilepticus: possible impact on GABAergic neurotransmission
Place of publication or event: Centro de Neurociências e Biologia Celular, UC
Abstract: A epilepsia é uma doença crónica caracterizada por crises recorrentes não provocadas. A doença afecta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Em muitos pacientes com epilepsia, as convulsões são controladas com medicamentos antiepilépticos (DAEs), incluindo bloqueadores dos canais de sódio e potenciadores da função do neurotransmissor GABA. Porém, mais de 30% dos pacientes epilépticos não respondem ao tratamento devido a alterações nos mecanismos de plasticidade neuronal. Uma explicação para esse fenómeno prende-se com o facto das convulsões recorrentes levarem a uma internalização progressiva dos receptores do GABA do tipo A (GABAAR) pós-sinápticos e a uma consequente diminuição da actividade inibitória. Um importante mecanismo agora emergente, que poderá também contribuir para a regulação negativa da atividade inibitória do GABA, envolve um desvio positivo do potencial de reversão dos GABAAR devido a uma alteração na homeostase do cloreto. Além da internalização dos GABAAR, que diminui os efeitos inibitórios do GABA no cérebro epiléptico, estudos recentes mostraram também uma regulação negativa do co-transportador de K+-Cl- KCC2 com um consequente desvio positivo do potencial de reversão do GABAAR devido a uma alteração na homeostasia do cloreto. Recentemente, outros estudos mostraram que a disfunção do KCC2 pode, de facto, contribuir para o processo de epileptogénese. Tendo em consideração as observações anteriores, no presente trabalho foi investigado o efeito do estado de mal epiléptico (SE) na expressão do KCC2, e a sua contribuição para a alteração da expressão e da atividade dos GABAAR em neurónios do hipocampo. Os resultados deste estudo mostraram que a exposição dos neurónios do hipocampo a um meio sem Mg2+, usado como modelo in vitro de SE, regula negativamente a expressão do KCC2 na membrana, como demonstrado pelos resultados das experiências de imagiologia em células vivas e de imunocitoquímica. A redução dos níveis de KCC2 observada na membrana foi correlacionada com um aumento da [Cl-]i, como demonstrado por experiências de imagiologia confocal em células vivas, realizadas usando um indicador de cloreto raciométrico codificado geneticamente. A contribuição da internalização dos transportadores KCC2 para as alterações observadas na [Cl-]i foi testada através de experiências de imagiologia em células vivas na presença de dinasore, um inibidor específico da endocitose dependente de clatrina. Os resultados mostraram que o dinasore leva a uma abolição dos efeitos do SE sobre a expressão do KCC2 na membrana plasmática, sugerindo que a redução dos níveis de KCC2 na membrana, induzida pelo SE, é mediada pela endocitose mediada por clatrina. Foi também testado o efeito da activação do transportador KCC2 na alteração da sua expressão membranar induzida pelo SE; para o efeito utilizou-se o composto CLP257 que estudos anteriores mostraram aumentar a atividade do KCC2. O CLP257 reduziu drasticamente os efeitos do SE sobre a distribuição do KCC2, mantendo a sua expressão muito mais estável na membrana quando comparado com a condição de SE na ausência de CLP257. Estes resultados sugerem que a ativação de KCC2 pode ser considerada uma possível estratégia para manter os níveis de membrana de KCC2 em condições de epilepsia, sugerindo o KCC2 como novo possível alvo para o tratamento da doença. Paralelamente às experiências realizadas na condição de SE, no presente trabalho caracterizou-se ainda a expressão de KCC2 em neurónios do hipocampo mostrando-se pela primeira vez a presença de KCC2 em axónios, apesar de em menor quantidade relativamente a dendrites e soma.Em conclusão, este trabalho contribui para a descoberta de novos mecanismos moleculares envolvidos no processo de epileptogénese, e para a compreensão dos fenómenos da fármaco-resistência.
Epilepsy is a chronic condition characterized by recurrent unprovoked seizures. The disease affects approximately 65 million people worldwide. In many patients with epilepsy, seizures are controlled with anti-epileptic drugs (AEDs), including blockers of sodium channels and enhancers of GABA function as a neurotransmitter. More than 30% of epileptic patients do not respond to the treatment because of changes in neuronal plasticity mechanisms. One explanation for these observations is that recurrent seizures lead to a progressive internalization of postsynaptic GABAARs and to a consequent downregulation of synaptic inhibition. An important emerging mechanism that may also contribute to the downregulation of the inhibitory activity of GABA is a positive shift of the GABAAR reversal potential due to an alteration in chloride homeostasis. In addition to the internalization of GABAAR that decrease the inhibitory effects of GABA in the epileptic brain, recent studies also showed a downregulation in the surface expression of the K+-Cl- cotransporter KCC2 with a consequent positive shift of the GABAAR reversal potential due to an alteration in chloride homeostasis. Furthermore, recent studies provided evidence that dysfunction of KCC2 may indeed predispose to epilepsy in humans. Taking into account these observations, in the present work we aimed at investigating the effect of Status Epilepticus (SE) on KCC2 distribution and the impact on GABAAR surface expression and activity in hippocampal neurons. The results showed that exposure of hippocampal neurons to a medium without Mg2+, which was used as in vitro model of SE, downregulates KCC2 surface expression as demonstrated by live imaging and immunocitochemistry experiments. The observed reduction of KCC2 levels in the membrane was correlated with an increase in the [Cl-]i, as demonstrated by confocal live imaging experiments using a genetically encoded ratiometric indicator for chloride. A possible cause of the observed alteration in the [Cl-]i is an increase of KCC2 internalization which was tested by live imaging experiments in presence of the specific inhibitor of clathrin dependent endocytosis dynasore. The results showed that dynasore abolished the effects of SE on the expression of KCC2 in the plasma membrane suggesting that the reduction of KCC2 surface levels induced by the epileptogenic activity in vitro was mediated by clathrin-mediated endocytosis. We also investigated the effect of KCC2 activity on SE-induced alteration of KCC2 membrane expression; these experiments were performed in the presence of CLP257, a compound that was shown to enhance KCC2 activity. Interestingly, CLP257 drastically reduced the SE effects on the distribution of KCC2, maintaining its surface expression much more stable when compared with the SE condition in absence of CLP257. These results suggest that activation of KCC2 may be considered a possible strategy to maintain the surface levels of the transporter in epileptic conditions, and indicate that KCC2 may be a new target for the treatment of epilepsy. In parallel to the experiments performed in SE conditions, in the present work we also characterized the expression of KCC2 in cultured hippocampal neurons. The results showed the presence of KCC2 in axons, although the expression levels were lower when compared whit dendrites and soma.In conclusion, this work contributes to uncover a new molecular mechanism involved in the process of epileptogenesis, and to the understanding of pharmacoresistance phenomena.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/89589
Rights: embargoedAccess
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