Monitoring of ripening-derived composition and morphology modifications in Arbutus unedo L. fruits, and characterization of vitrified tissues

Abstract

A familía Ericaceae é constítuida por várias espécies economicamente importantes, tais como as pertencentes ao género Rhododendron and Vaccinium. Entre elas, o arbusto mediterrânico Arbutus unedo L. destaca-se do ponto de vista pomológico e ornamental. Para aprofundar o conhecimento sobre esta espécie, analisaram-se as alterações morfológicas e composicionais que ocorrem na ontogenia dos frutos, com o objetivo de identificar fatores e eventos relacionados com a sua maturação. Deste modo, os resultados da execução de FTIR revelaram alterações ao nível dos polissacarídeos estruturais da parede celular, entre frutos imaturos e maduros. Investigações espetroscópicas adicionais com biomassa intacta dos frutos, revelaram que existem variações composicionais, principalmente decorrentes de polissacarídeos da matriz, tais como as pectinas e hemicelulloses, e também celulose. No decorrer da maturação verificou-se também um aumento no teor de sólidos solúveis totais (˚Brix), e um decréscimo na acidez dos frutos. Por outro lado, a degradação de açúcares estruturais que advém da hidrólise e/ou do processo oxidativo, resulta num decréscimo acentuado da firmeza dos frutos, que leva ao seu amolecimento, e também a variações do seu diâmetro polar e equatorial. Além disso, traçou-se um perfil fenólico preliminar dos frutos recorrendo a RP-HPLC-PDA, concluindo-se que ocorrem poucas variações desses compostos durante a maturação. Por sua vez, no que diz respeito à vitrificação de tecidos, decorrente da sua cultura em meio líquido, investigou-se a parede celular de folhas e caules vitrificados, comparando depois com tecidos não vitrificados. As diferenças nos teores de celulose, polissacarídeos da matriz e lenhina, entre material in vitro não vitrificado e vitrificado, foram reveladas através de técnicas como FTIR., lenhina solúvel em brometo de acetil e quantificação de carbohidratos totais. Contrariamente ao que poderia ser expectável e ao que é normalmente indicado na literatura, os resultados obtidos mostraram, de forma consistente, um teor de lenhina mais elevado nas folhas do que nos caules. Por outro lado, através de microscopia ótica de campo claro, fluorescência e varrimento, revelaram-se informações meticulosas sobre a anatomia de A. unedo, através de comparações entre folhas e caules de um arbusto e de material in vitro, vitrificado e não vitrificado. Em comparação com folhas normais, as vitrificadas evidenciaram uma epiderme desorganizada e fina, com imensos complexos estomáticos anormais presentes na página inferior da folha. O mesófilo apresentava grandes espaços lacunares e não existia um parênquima em paliçada bem definido. No que diz respeito aos caules, as principais diferenças estão relacionadas com as células corticais muito espaçadas devido à presença de pronunciados espaços intercelulares. A presente dissertação contribui para um melhor conhecimento desta espécie economicamente importante, mas pouco conhecida, não só pelo melhor conhecimento do processo de maturação dos frutos, mas também por ajudar a perceber as alterações morfológicas e químicas num fenótipo vitrificado.

The Ericaceae family comprises a wide number of economic relevant species, such as the plants belonging to the Rhododendron and Vaccinium genera. Among them, the Mediterranean evergreen shrub Arbutus unedo L. outstands from the pomological and ornamental point of view. For an in-depth knowledge of this plant, the ripening-derived composition and morphology was monitored, aiming at identifying factors and events related with fruit maturation. Accordingly, to explore the ripening-derived compositional differences, FTIR spectroscopy was performed, founding chemical variations related to the structural polysaccharides of the cell wall, between immature and fully ripen fruits. Further spectroscopic investigations using the fruits intact biomass, revealed more variations, mainly due to matrix polysaccharides like pectins and hemicelluloses, and cellulose. The process of maturation was also found to be related to an increase of total soluble solids content (˚Brix), and a decrease in fruits acidity. Notwithstanding, the hydrolysis and/or oxidative derived-degradation of structural sugars, results in an extreme decline of fruit firmness, leading to fruit softening, and variations in the polar and equatorial diameters. Furthermore, a preliminary phenolic profile of the fruits was also investigated by RP-HPLC-PDA, and only slight variations of the phenolic compounds were observed during fruit maturation. On the other hand, concerning the vitrification (hyperhydricity) phenomenon that outcomes through the culture of axillary shoots in liquid medium, the cell wall of non-vitrified and vitrified in vitro shoots of A. unedo was evaluated, comparing leaves and stems. Regarding on the differences in the amounts of cellulose, matrix polysaccharides and lignin, compositional differences were uncovered in leaves and stems from in vitro shoots, using FTIR spectroscopy, acetyl-bromide soluble lignin method and total carbohydrates estimation. Unexpectedly, our results showed higher amounts of lignin in leaves, comparing to stems. Additionally, meticulous information about the A unedo anatomy was assessed by light, fluorescence and scanning electron microscopy, making comparisons between leaves and stems of non-vitrified and vitrified in vitro shoots, and tissues from a strawberry tree. Comparing with normal leaves, the vitrified ones showed to have a delicate and disorganized epidermis, with many abnormal stomata present in the abaxial surface. The mesophyll has wide lacunar spaces, and lack of palisade parenchyma. Concerning vitrified stems, the major differences relied on the the broad-spaced cortical cells. In the end, the present dissertation contributed to better characterization of this economic relevant species but largely unknown, not only for a better understanding on the fruits ripening events, but also by helping to unveil the chemical and anatomy-related factors of the vitrified phenotype.