Nanossistemas para transporte e entrega de fármacos e material genético a células de carcinoma hepatocelular

Abstract

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das neoplasias com maior taxa de mortalidade. Embora esteja associado a várias opções de tratamento, as curativas estão limitadas a uma pequena percentagem dos utentes. Adicionalmente, a maior parte destes tratamentos está associada a uma reduzida eficiência e a elevados efeitos secundários. Neste sentido, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas mediadas por nanossistemas poderá contribuir para uma maior eficácia terapêutica. Neste contexto, as nanopartículas de sílica mesoporosas (MSNs) apresentam-se como sistemas promissores para o transporte de fármacos e material genético. As suas propriedades, como a biocompatibilidade, estrutura estável, grande área de superfície, volume e tamanho de poros uniforme e ajustável, e a possibilidade de serem funcionalizadas, fazem das MSNs um sistema com elevado potencial para o transporte e entrega de fármacos e material genético às células alvo.O principal objetivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de MSNs, responsivas ao pH e estímulos Redox, para a co-entrega de fármacos e material genético a células de CHC. Com este propósito, foram utilizados como precursores de sílica, o ortosilicato de tetraetilo (TEOS) e o tetrassulfureto de bis[propilo de 3-(trietoxisilano)] (BTESPT), e como surfactantes o Pluronic F127 e o brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB). As nanopartículas obtidas (MSN-OH) foram depois funcionalizadas com 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (MSN-NH2) de forma a permitir a complexação de ácidos nucleicos. Após a formação dos complexos MSN-NH2/ADN, foi ainda feito um revestimento com poli(β-amino ester) (PβAE) (MSN-NH2/ADN/PβAE) de modo a conferir proteção ao material genético.As nanopartículas obtidas (MSN-OH e MSN-NH2) foram caracterizadas por difusão dinâmica da Luz (DLS), potencial zeta (PZ), Espetroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e quantificação de aminas, sendo que estes ensaios permitiram determinar o diâmetro médio e carga superficial dos nanossitemas, assim como confirmar a presença de grupos amina na formulação MSN-NH2. Adicionalmente, os nanossistemas desenvolvidos revelaram capacidade para carregar epirrubicina, assim como para a libertar em determinadas condições de pH e na presença de glutationa reduzida (GSH). Estudos de citotoxicidade realizados numa linha celular de CHC, mostraram que estas nanopartículas não são tóxicas por si só, apresentando elevada toxicidade quando carregadas com epirrubicina.As MSN-NH2 revelaram ainda a capacidade de complexar material genético, tendo-se confirmado também o revestimento com PβAE, ou seja, a formação das nanopartículas híbridas MSN-NH2/ADN/PβAE. Adicionalmente, tendo em conta os resultados obtidos nos ensaios de intercalação de brometo de etídio e eletroforese em gel de agarose, as nanopartículas híbridas mostraram elevada capacidade de condensação e proteção dos ácidos nucleicos, contribuindo também para evidenciar o seu potencial enquanto sistemas de transporte e entrega de ácidos nucleicos.

The hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the cancers with highest mortality rate. Despite the several treatment options available, the curative ones are limited to a small percentage of patients. Additionally, most part of these treatments is associated to a reduced efficiency and high levels of side effects. In this regard, the development of new therapeutic strategies mediated by nanosystems could contribute to higher therapeutic efficacy.In this context, mesoporous silica nanoparticles (MSNs) are promising systems for the transport of drugs and genetic material. Their properties, such as, biocompatibility, stable structure, large surface area, uniform and tunable pore size and volume, and the possibility of being functionalized, make MSNs a system with high potential for drug and gene delivery into target cells.The main goal of this work was the development of pH and redox-responsive MSNs for the co-delivery of drugs and genetic material to HCC cells. For this propose, tetraethyl ortosilicate (TEOS) and bis[3-(triethoxysilyl) propyl] (BTESPT) were used as silica precursors, and Pluronic F127 and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) as surfactants. The obtained nanoparticles (MSN-OH) were then functionalized with 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES) (MSN-NH2) in order to allow the nucleic acids complexation. After the preparation of the MSN-NH2/DNA complexes, they were coated with poli(β-amino ester) (PβAE) (MSN-NH2/DNA/PβAE) in order to confer protection to genetic material.The obtained nanoparticles (MSN-OH and MSN-NH2) were characterized by dynamic light scattering (DLS), zeta potential (ZP), Fourier-Transform Infrared spectroscopy (FTIR) and quantification of the amino groups (MSN-NH2). These assays allowed the determination of the mean diameter and surface charge of the nanosystems, as well as the confirmation of the presence of amino groups in the formulation MSN-NH2. Additionally, the developed nanosystems also revealed the ability to load epirubicin and to release it in the presence of an acidic pH and reduced glutathione (GSH). The cytotoxicity of the nanosystems was tested in an HCC cell line and revealed that they were non-toxic by themselves, presenting high toxicity when loaded with epirubicin.The MSN-NH2 still demonstrated the ability to complex the genetic material, having also confirmed the coating with PβAE, and consequently the successful preparation of the hybrid nanoparticles MSN-NH2/ADN/PβAE. Moreover, considering the results obtained on both the ethidium bromide intercalation assay and the agarose gel electrophoresis assay, hybrid nanosystems showed high ability to condense and protect the nucleic acids, also contributing to emphasize their potential as gene delivery system.