Evaluation of ageing-related molecular and bioenergetic alterations in bovine oocytes

Abstract

O envelhecimento do sistema reprodutor feminino, atualmente um problema de saúde emergente, envolve diversas alterações funcionais e estruturais nos gâmetas, nas células somáticas adjacentes e no tecido ovárico. Consequentemente, é de extrema importância estudar as modificações resultantes do envelhecimento, para que novas estratégias terapêuticas sejam criadas, no sentido de melhorar a função reprodutora da mulher de idade mais avançada. Porém, existem alguns constrangimentos a este tipo de estudos tais como, os problemas éticos inerentes a estudos em humanos e o reduzido número de amostras passíveis de serem obtidas. No sentido de superar estes problemas, têm sido utilizados diferentes modelos animais para estudar as modificações relacionadas com o envelhecimento do sistema reprodutor feminino, tendo já sido evidenciado nestes animais diversas alterações morfológicas e biomoleculares. Contudo, ainda não existe um modelo animal único, semelhante ao ser humano, que permita demonstrar todas as alterações até agora detetadas, tornando difícil a extrapolação da informação para o envelhecimento reprodutivo da mulher.Este estudo visa caracterizar as modificações induzidas in vitro relacionadas com o envelhecimento, bem como determinar se o modelo de envelhecimento in vitro é um método adequado para estudar o envelhecimento do sistema reprodutor humano. Assim, utilizando o bovino como modelo animal, foram avaliados diferentes parâmetros morfológicos e biomoleculares no modelo de envelhecimento in vitro, e comparados com as modificações que decorrem in vivo e com outras informações já reportadas na literatura sobre outros modelos animais ou em humanos. Neste estudo, decorrente do envelhecimento in vitro e in vivo, verificaram-se alterações em parâmetros oocitários e nas respetivas células do cúmulos. Foram detetadas alterações como a diminuição do volume ooplásmico e o aumento da espessura da zona pelúcida após o envelhecimento in vitro. Por outro lado, este processo parece não alterar a massa mitocondrial intracelular, causando, porém, um aumento significativo das espécies reativas de oxigénio, como foi avaliado por microscopia de fluorescência. Relativamente à análise biomolecular, detetou-se uma tendência para a diminuição do ADN mitocondrial nos oócitos e respetivas células do cúmulos, envelhecidos in vitro. Assim, com exceção do volume dos oócitos, todas as alterações decorrentes do envelhecimento in vitro parecem ter a mesma tendência que o grupo de oócitos envelhecidos in vivo. Em conclusão, este método de envelhecimento in vitro pode ser considerado um método adequado para o estudo do envelhecimento oocitário.

Female reproductive ageing is an emerging health problem which involves many functional and structural alterations in oocytes, adjacent somatic cells and ovarian tissue. It is of great importance to study these ageing-related alterations to design better therapeutic approaches to improve the reproductive function of women of advanced age. An important constraint to this type of studies are the inherent ethical problems of working with human gametes, and the limited amount of samples. To overcome these difficulties, animal models have been intensively used, and several different morphological and biomolecular modifications have been pointed out. However, there is a lack of a single ageing model similar to humans in which all the important age-related alterations have been detected, making it hard to make robust conclusions and extrapolations for human ageing.This study aims to characterize the in vitro-induced age-related modifications in a bovine model, as well as to determine if our model is a reliable approach to study human ageing. For this purpose, different morphological and biomolecular in vitro-induced alterations in the bovine animal model were compared to the in vivo aged group and to the already reported information regarding humans and other animal models.Oocytes and cumulus cells parameters were altered upon in vitro and in vivo ageing. Indeed, a significant decrease in oocyte cytoplasmic volume was found, whereas zona pellucida thickness increased after in vitro ageing. On the other hand, no influence on mitochondrial mass was found, however, a significant increase in mitochondrial reactive oxygen species was detected, in both cases using fluorescent microscopy. In what concerns the evaluated biomolecular parameters, a decreasing tendency in mitochondrial DNA content was found, in both in vitro aged oocytes and their respective cumulus cells. Therefore, except for cytoplasmic volume, all the in vitro-induced alterations showed the same tendency as the in vivo aged group. In conclusion, our in vitro approach of inducing ageing-related alterations may be considered as a reliable approach to study the ageing process in female gametes.