The role of P2 receptors in the migration of medial ganglionic eminence-derived interneurons

Abstract

The cerebral cortex circuitry relies essentially on a balanced network between excitatory pyramidal neurons and inhibitory GABAergic interneurons. One of the fundamental processes for the establishment of such correctly wired circuitry is neuronal migration. Indeed, impairment of neuronal migration is among the most common causes of cortical malformation disorders and, particularly, inhibitory interneuron defects have been often associated with several neurological and psychiatric disorders. Thus, it is paramount to unravel the precise mechanisms underlying interneuron migration. In this regard, it was recently shown that purinergic signalling contributes to neuronal migration as it was reported that the pharmacological blockade of adenosine A2A receptors delays migration and insertion of interneurons into the hippocampal circuitry. Moreover, it has also been reported that P2Y1R is crucial for the migration of intermediate neuronal progenitors and proper formation of the cortical SVZ. Besides, it has been recently shown that P2 receptors can bidirectionally modulate neurite outgrowth, a crucial event for neuronal migration. This has prompted the study of the role of purinergic receptors in interneuron migration. Hence, the main aim of this work was to identify and characterize the role of P2 receptors in the migration of interneurons derived from the MGE, the main source of cortical GABAergic interneurons. It was found that P2Y1R is expressed in the brain at mid-late stages of embryogenesis (E12.5-onwards), coincident with the onset of interneuron migration, and particularly in MGE-derived interneurons (E13.5). Its presence was functionally appraised by the observation of intracellular Ca2+ transients induced by a selective agonist of P2Y1R, MRS2365 (100 nM). By using an ex vivo model consisting in 3D cultures of MGE explants from E13.5 mice brains, it was observed that the blockade of P2Y1R with the selective antagonists MRS2179 (10 µM) or MRS2500 (10 µM) significantly decreased the migration of interneurons from the MGE explants. This effect was mimicked by apyrase (20 U/mL), an enzyme that catabolizes ATP and ADP into AMP, being the migration restored upon the pharmacological activation of P2Y1R with MRS2365 (100 nM). This effect is mediated by PKC as it was arrested by the presence of a PKC inhibitor (BIM-1, 500 nM). Therefore, these data show for the first time that P2Y1R is expressed and tonically promotes MGE-derived interneuron migration through PKC activation. In contrast, the P2X-preferring agonist BzATP (1, 10, 100 µM) inhibited MGE-derived interneuron migration in a concentration-dependent manner, an effect prevented by the blockade of P2 receptors (PPADS, 10 µM), by the selective blockade of P2X1R (NF279, 1 µM), but not modified by the selective P2X7R antagonist A438079 (10 µM). These results demonstrate that P2X1R inhibits MGE-derived interneuron migration. Although the inhibitory effect of BzATP on interneuron migration is not mediated by P2X7R, it was also observed that P2X7R is tonically contributing to the migration of MGE-derived interneurons based on the observation that the P2X7R blockade with two different selective antagonists, A438079 (10 µM) and A740003 (10 µM), inhibited interneuron migration. At the cellular level, it was gathered evidence indicating that P2Y1R may be promoting interneuron migration by contributing to leading process branching, a critical step in the saltatory movement cycle. Instead, P2X1R-induced inhibition of MGE-derived interneuron migration should be caused by disruption of the formation of new leading process branches affecting cell orientation, utterly suggesting a relationship between P2 receptors and cytoskeleton dynamics. This is supported by the expression and localization of P2Y1R and P2X1R in the leading processes of MGE cells, including at the most distal end. Conversely, P2X7R expression in MGE interneurons is restricted to the soma and proximal part of the leading process, which is in accordance with its lack of involvement on the BzATP-induced inhibition of migration. Furthermore, it was also provided evidence suggesting that the regulation of leading process dynamics by P2Y1R may be attained by the modulation of CRMP2 phosphorylation, a microtubule-associated protein that plays a crucial role in axonal guidance and outgrowth. The selective blockade of P2Y1R (MRS2179, 10 µM) increased the inhibitory phosphorylation of CRMP2T514 most likely reflecting the observed decrease of the inhibitory phosphorylation of GSK3βS9. These modifications were accompanied by a reduction of the number and size of growth cones in MGE cells, which may be due to induced growth cone collapse. Thus, these observations indicate that P2Y1R may regulate leading process dynamics and the migration of MGE-derived interneurons through GSK3β-CRMP2 pathway. This work further shows that immunoreactivity for P2X1R in the E13.5 embryonic telencephalon is mostly found in βIII-tubulin-positive migratory neurons in contrast to the predominant expression of P2Y1R in proliferative zones (βIII-tubulin-negative) including in the MGE. Besides, it was shown that P2X1R impairs cell orientation of MGE-derived interneurons, in opposition of P2Y1R that does not influence their guidance. Together, this evidence supports a scenario in which P2Y1R promotes interneuron migration as a motogenic factor in the MGE, while the P2X1R should be contributing for their guidance by transducing ATP as a repulsive cue. Indeed, it was observed that P2Y1R and P2XRs control neuronal migration of MGE-derived interneurons in a differential time-dependent manner, wherein the contribution of P2Y1R activity seems particularly relevant in the initial phase of migration, while the ability of P2XR activation to inhibit migration is kept at later periods of migration. This supports the postulated hypothesis of P2Y1R acting as a motogenic receptor to promote the initial migration of cells away from the proliferative zones, and P2X1R as a guidance receptor in the control of MGE-derived interneuron migration. Overall, this study provides compelling evidence that rise P2 receptors as novel players in the control of interneuron migration during development and re-enforces for the pivotal role of purinergic signalling in neuronal migration and in corticogenesis.

O circuito do córtex cerebral depende essencialmente de uma rede equilibrada entre neurónios piramidais excitatórios e interneurónios GABAérgicos inibitórios. Um dos processos fundamentais para o estabelecimento correto destes circuitos é a migração neuronal. A diminuição e bloqueio da migração neuronal estão entre as causas mais comuns de malformações corticais e, em particular, defeitos nos interneurónios inibitórios têm vindo a ser associados a diversas patologias neurológicas e psiquiátricas. É, portanto, importante desvendar os mecanismos subjacentes à migração de interneurónios. A este respeito, foi recentemente demonstrado que a sinalização purinérgica contribui para a migração neuronal uma vez que foi reportado que bloqueio farmacológico dos receptores de adenosina A2A retardam a migração e inserção de interneurónios na rede neuronal do hipocampo. Também, foi reportado que os receptores P2Y1 (P2Y1R) são cruciais para a migração de progenitores neurais intermediários e para a correta formação da camada subventricular do córtex. Recentemente foi ainda mostrado que os receptores P2 podem modular bidireccionalmente o crescimento de neurites, que é um evento importante para a migração neuronal. Estas evidências levaram ao estudo do papel dos receptores purinérgios na migração de interneurónios. O principal objectivo deste trabalho foi então identificar e caracterizar o papel dos receptores P2 na migração de interneurónios derivados da eminência ganglionar medial (“MGE” do inglês medial ganglionic eminence), que é a principal fonte de interneurónios GABAérgicos do córtex. Verificou-se que os P2Y1R são expressos no cérebro em estágios intermédios e tardios da embriogénese (E12.5 em diante), coincidentes com o início da migração de interneurónios, e particularmente em interneurónios derivados da “MGE” (E13.5). A presença destes receptores foi ainda verificada funcionalmente através da observação de transientes de Ca2+ intracelular induzidos por um agonista selectivo dos P2Y1R, MRS2365 (100 nM). Ao usar um modelo ex vivo, que consiste em culturas 3D de explantes da “MGE” de cérebros de murganho com 13.5 dias de gestação (E13.5), foi observado que o bloqueio dos P2Y1R com os antagonistas selectivos MRS2179 (10 µM) ou MRS2500 (10 µM) diminuiu significativamente a migração de interneurónios dos explantes da “MGE”. Este efeito foi mimetizado pela apirase (20 U/mL), uma enzima que cataboliza o ATP e ADP em AMP, sendo a migração restaurada após a activação farmacológica dos P2Y1R com MRS2365 (100 nM). Este efeito é mediado pela PKC uma vez que foi prevenido pela presença de um inibidor da PKC (BIM-1, 500 nM). Portanto, estes resultados mostram pela primeira vez que os P2Y1R são expressos e promovem tonicamente a migração de interneurónios derivados da “MGE” através da activação da PKC. Em contraste, o agonista BzATP (1, 10, 100 µM), que se liga preferencialmente a receptores P2X (P2XR), inibiu a migração de interneurónios derivados da “MGE” de uma forma dependente da concentração, um efeito que foi prevenido pelo bloqueio dos receptores P2 (PPADS, 10 µM), pelo bloqueio selectivo dos P2X1R (NF279, 1 µM) mas não é modificado pelo agonista selectivo dos P2X7R, A438079 (10 µM). Estes resultados demonstram que os P2X1R inibem a migração de interneurónios da “MGE”. Apesar do efeito inibitório do BzATP da migração de interneurónios não ser mediado pelos P2X7R, foi também observado que os P2X7R estão tonicamente a promover a migração de interneurónios derivados da “MGE” com base na observação que o bloqueio dos P2X7R com dois antagonistas selectivos diferentes, A438079 (10 µM) e A740003 (10 µM), inibiram a migração de interneurónios. Ao nível celular, foram reunidas evidências indicando que os P2Y1R devem estar a promover a migração de interneurónios ao contribuírem para a ramificação do “leading process”, um passo crítico no ciclo de movimento saltatório; ao contrário que a inibição da migração de interneurónios da “MGE” induzida pelos P2X1R deve estar a ser causada através da perturbação da formação de novos ramos do “leading process” afectando a orientação celular. Isto sugere assim uma relação entre os receptores P2 e a dinâmica do citoesqueleto. Isto é sustentado pela expressão e localização dos P2Y1R e P2X1R nos “leading processes” das células da “MGE”, incluindo na parte mais distal desses prolongamentos. Contrariamente, a expressão de P2X7R nos interneurónios da MGE é restrita ao corpo celular e parte proximal do “leading process”, estando de acordo com o não envolvimento dos P2X7R na inibição da migração induzida por BzATP. Adicionalmente, foram também obtidas evidências sugerindo que a regulação da dinâmica do “leading process” pelos P2Y1R deverá ser obtida através da modulação da fosforilação da CRMP2, uma proteína associada a microtúbulos que desempenha um papel crucial no crescimento e condução de axónios. O bloqueio selectivo dos P2Y1R (MRS2179, 10 µM) aumentou a fosforilação inibitória da CRMP2T514, possivelmente reflectindo o decréscimo da fosforilação inibitória da GSK3βS9. Estas modificações foram acompanhadas por uma redução no número e tamanho dos cones de crescimento nas células da “MGE”, o que poderá ser devido à indução do seu colapso. Portanto, estas observações indicam que os P2Y1R poderão regular a dinâmica do “leading process” e a migração dos interneurónios da “MGE” através da via GSK3β-CRMP2. Este trabalho mostra ainda que a imunoreactividade dos P2X1R no telencéfalo a E13.5 é maioritariamente encontrada em neurónios migratórios positivos para a βIII-tubulina, o que contrasta com a expressão predominante dos P2Y1R nas regiões proliferativas (negativas para βIII-tubulina) incluindo na “MGE”. Para além disso, foi observado que os P2X1R perturbam a orientação dos interneurónios derivados da “MGE”, em oposição aos P2Y1R que não influenciam a sua orientação. Em conjunto, estas evidências suportam um cenário em que os P2Y1R poderão promover a migração de interneurónios ao actuar como um factor motogénico na “MGE”, enquanto que os P2X1R deverão estar a contribuir para a sua condução ao interpretar o ATP como um sinal repulsivo. De facto, foi observado que os P2Y1R e P2XRs controlam diferencialmente a migração de interneurónios da “MGE” de uma forma dependente do tempo, em que a contribuição da actividade dos P2Y1R parece particularmente relevante numa fase inicial da migração, enquanto que a capacidade da activação dos P2XR para inibir a migração é mantida em períodos mais tardios da migração. Isto suporta a hipótese postulada de que os P2Y1R actuam como receptores motogénicos para promover a migração inicial das células longe das zonas proliferativas, e os P2X1R como receptores de orientação no controlo da migração de interneurónios derivados da “MGE”. No geral, esta tese fornece fortes evidências que estabelecem os receptores P2 como novos moduladores no controlo da migração de interneurónios durante o desenvolvimento e reforça o papel fulcral da sinalização purinérgica na migração neuronal e na corticogénese.