Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/87585
Title: Pathophysiology of Doxorubicin Cardiotoxicity: From Mitochondrial Homeostasis to Biological Clocks
Authors: Ferreira, Luciana Carolina Lopes
Orientador: Oliveira, Paulo
Laranjinha, João
Keywords: Doxorubicin; Cardiotoxicity; Heart; Mitochondria; Apoptosis; Circadian rhythm
Issue Date: 26-Jun-2019
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/52429/2013/PT/PATHOPHYSIOLOGY OF PERSISTENT DOXORUBICIN CARDIOTOXICITY : A MITOCHONDRIAL-EPIGENETICS LINK 
PTDC/DTP­FTO/1180/201 
POCI-01-0145-FEDER-007440 
Abstract: Doxorubicin is one of the most widely used chemotherapeutic agents due to its effectiveness against a broad-spectrum of malignancies. However, its clinical use is hampered by severe dose-dependent and cumulative cardiotoxic side effects that lead to cardiomyopathies and congestive heart failure. Importantly, late-onset symptoms of cardiac toxicity have been observed in childhood cancer survivors. Despite the advances in the field in terms of preventive measures and doxorubicin delivery mechanisms, the cardiotoxicity is still a treatment bottleneck. Mitochondrial dysfunction and DNA damage are the mechanisms that better explain the toxicity of doxorubicin, but it is believed that is a combination of effects that leads to the life-threatening heart problems. Therefore, it is important to elucidate the various aspects of the pathophysiology of doxorubicin-associated cardiotoxicity in order to establish targeted interventions that could minimize the side effects without interfering with the anticancer capacity. The present dissertation aims to contribute for the understanding of mechanisms underlying acute and chronic forms of doxorubicin-induced cardiotoxicity, and several research questions related with this subject are addressed. The first question was whether preconditioning of myoblastic H9c2 cell line with sub-clinical doses of doxorubicin would lead to an increase of cellular defenses and overall resistance against a further and higher dose exposure of doxorubicin (Chapter 5). We observed that doxorubicin pre-treatment, in low doses, was able to protect cell viability and mitochondrial activity from further damage by higher concentrations, without, apparently, interfering with the anticancer capacity. Even though the mechanisms were not completely elucidated, the results suggest the induction of a beneficial and possibly epigenetic-based mitochondrial adaptation. Multiple studies in doxorubicin field have been performed with H9c2 cardiomyoblasts over the past years. However, other in vitro models have gained interest due to their resemblance with mature cardiomyocytes, including induced-pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes. Thus, our next aim was to conduct acute doxoxubicin-exposure experiments to investigate the morphological, functional and biochemical changes occurring in the iPSC-derived mouse cardiomyocytes and validate these cells as a model to study doxorubicin-induced cardiotoxicity (Chapter 6). Our results reinforced the dose-dependent nature of doxorubicin cardiotoxicity. From the two different concentrations of doxorubicin tested (0.5 and 1 µM), the highest dose of drug induced a high degree of apoptosis, while the lowest dose led to early apoptotic events, decreased mitochondrial oxygen consumption rates and inhibition of pyruvate dehydrogenase by PDK4. The effects were partially prevented upon pre-treatment with the PDK inhibitor dichloroacetate. Lastly, it was hypothesized that doxorubicin exposure early in life could induce long-term cardiac dysfunction and compromise the normal transcriptional and signaling circadian homeostasis (Chapter 7). This assumption relied on the fact that the circadian clock, an important system for the maintenance of cardiac functions, is driven by the interplay with cellular metabolism and energy status. To test this hypothesis, juvenile C57BL/6J male mice (4 weeks age) were subjected to a sub-chronic doxorubicin treatment and several cardiac parameters were analyzed after a long period of recovery time. We observed that doxorubicin induced long-term cardiac dysfunction and interfered with oscillatory molecular mechanisms including gene expression rhythmicity and acetylation profiles of histone 3 (H3) and Bmal1. The molecular mechanisms behind doxorubicin detrimental effects were also supported by studies with synchronized murine embryonic fibroblasts (MEFs) and HEK293 cells. Overall the results presented in this thesis not only reinforce previous observations regarding doxorubicin impact on mitochondrial function, metabolic remodeling and long-term transcriptional homeostasis but also describe, for the first time, other mechanisms of doxorubicin toxicity including the impact on pyruvate dehydrogenase complex and circadian rhythms. Furthermore, we demonstrated that doxorubicin preconditioning could be an interesting strategy during anticancer therapies. In conclusion, our data helped to clarify several aspects of doxorubicin impact on cardiac cells and hopefully contribute to a better understanding of its pathogenesis and development of more effective interventions.
A doxorubicina é um dos fármacos antineoplásicos mais amplamente utilizados devido à sua eficácia no tratamento de um vasto espectro de cancros. No entanto, a sua utilização clínica é limitada por graves efeitos secundários associados à cardiotoxicidade cumulativa dependente da dose que pode levar ao desenvolvimento de cardiomiopatias e insuficiência cardíaca. Um aspeto particularmente importante é o facto de sintomas persistentes da toxicidade cardíaca terem sido observados em sobreviventes de cancros infantis. Apesar dos avanços em medidas preventivas e mecanismos de administração controlados, a cardiotoxicidade continua a ser o maior obstáculo à eficácia do tratamento. A disfunção mitocondrial e os danos ao nível do DNA são os mecanismos que melhor explicam a toxicidade da doxorubicina. No entanto, acredita-se que é uma combinação de fatores que contribuem para os problemas cardíacos que podem pôr em causa a vida do paciente. Assim sendo, é importante elucidar os vários aspetos da fisiopatologia da cardiotoxicidade associada à doxorubicina de forma a estabelecer intervenções específicas que possam minimizar os efeitos secundários sem interferir com a capacidade anticancerígena. Esta dissertação tem como principal objetivo contribuir para a compreensão dos mecanismos subjacentes à cardiotoxicidade aguda e crónica induzida pela doxorubicina, sendo abordados vários aspetos no âmbito desta temática. A primeira questão que se colocou foi se o pré-condicionamento da linha celular mioblástica H9c2 com doses subclínicas de doxorubicina induziria o aumento das defesas celulares e a resistência contra uma segunda exposição à doxorubicina em doses mais elevadas (Capítulo 5). O pré-tratamento com doses baixas de doxorubicina permitiu proteger a viabilidade celular e a atividade mitocondrial após uma segunda exposição a concentrações mais elevadas, sem que, aparentemente, a capacidade anticancerígena tenha sido afetada. Apesar de os mecanismos não terem sido completamente elucidados, os resultados sugerem a indução de uma adaptação mitocondrial, possivelmente relacionada com regulação epigenética. Nos últimos anos, vários estudos têm utilizado as células H9c2 como modelo de cardiotoxicidade induzida pela doxorubicina. No entanto, outros modelos in vitro têm ganho interesse devido à sua maior semelhança com cardiomiócitos maduros, incluindo cardiomiócitos derivados de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC). O nosso objetivo seguinte foi expôr cardiomiócitos de murganho derivados de iPSC a tratamentos agudos com doxorubicina, analisando as subsequentes alterações morfológicas, funcionais e bioquímicas e validar estas células como um modelo adequado para estudar a cardiotoxicidade associada à doxorubicina (Capítulo 6). Os nossos resultados reforçaram a dependência dose-efeito. Das duas concentrações de doxorubicina utilizadas (0.5 e 1 µM), a dose mais elevada induziu apoptose, enquanto que a dose mais baixa levou à ocorrência de fenómenos precedentes à apoptose, diminuição das taxas de consumo de oxigénio mitocondrial e inibição da piruvato desidrogenase pela PDK4. Os efeitos foram parcialmente prevenidos após pré-tratamento com o inibidor de PDK, dicloroacetato. Por último, colocou-se a hipótese de que a exposição à doxorubicina numa fase precoce poderia induzir, a longo prazo, disfunção cardíaca e comprometer a normal homeostasia de fenómenos de transcrição e sinalização circadianos (Capítulo 7). Este pressuposto baseou-se no facto de o relógio circadiano, um sistema importante na manutenção das funções cardíacas, ser dependente da interação entre o metabolismo e o estado energético celular. De modo a testar esta hipótese, murganhos C57BL/6J machos juvenis (4 semanas) foram sujeitos a um tratamento sub-crónico com doxorubicina e, após um período de recuperação, vários parâmetros cardíacos foram avaliados. Observou-se que a doxorubicina induziu disfunção cardíaca persistente e interferiu com mecanismos moleculares oscilatórios, incluindo ritmicidade da expressão genética e perfis de acetilação da histona 3 (H3) e Bmal1. Os mecanismos moleculares foram também suportados por estudos utilizando fibroblastos embrionários de murganho (MEFs) sincronizados e células HEK293. Os resultados apresentados nesta tese reforçam observações anteriores relativas ao impacto da doxorubicina na função mitocondrial e remodelação metabólica e transcriptómica, mas também descrevem, pela primeira vez, outros mecanismos da toxicidade da doxorubicina, incluindo o impacto no complexo piruvato desidrogenase e nos ritmos circadianos. Além disso, demonstrou-se que o pré-condicionamento com doxorubicina poderá ser uma estratégia relevante durante o processo de terapia anticancerígena. Em conclusão, os nossos resultados ajudaram a clarificar vários aspetos do impacto da doxorubicina em células cardíacas e possivelmente contribuir para uma melhor compreensão da sua patogénese e desenvolvimento de intervenções clínicas mais eficazes.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade Toxicologia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/87585
Rights: embargoedAccess
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