Complexos de Cobre derivados do imidazole: síntese e avaliação da atividade antitumoral

Abstract

Os cancros colorretal e da mama são muito frequentes e uma das principais causas de mortalidade. Atualmente, para além dos fármacos usados nos tratamentos de quimioterapia destes cancros, como o 5-FU, o irinotecano, etc, são também usados três complexos metálicos, a cisplatina, a carboplatina e a oxaliplatina. No entanto, estas opções quimioterapêuticas apresentam efeitos adversos e as células tumorais têm tendência a desenvolver resistência aos fármacos. Sendo assim, existe a necessidade de desenvolver novos agentes mais eficientes para quimioterapia.Num trabalho anterior, realizado na Unidade de Biofísica da Universidade de Coimbra, em parceria com o grupo de Orgânica do Departamento de Química, foram desenvolvidos complexos de 99mTc, modificados com ligandos derivados do 4-nitroimidazole com o objetivo de serem usados na deteção de hipóxia tumoral. Os resultados revelaram que os complexos conseguiam atravessar a membrana celular e acumular nas células tumorais, postulou-se a hipótese de que a substituição do tecnécio por cobre poderia conferir atividade citotóxica aos complexos. Estudos anteriores revelaram que os complexos de Cu(II) apresentavam atividade antitumoral, sendo capazes de provocar morte celular, e que alguns imidazóis e derivados apresentam atividade farmacológica, incluindo atividade antitumoral.Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo a síntese de novos complexos de Cu(II) derivados do imidazole e posterior avaliação da sua atividade antitumoral, com recurso a testes in vitro, nas linhas celulares de cancro colorretal, LS1034 e WiDr, e da mama, MCF-7 e HCC1806.Numa primeira fase, sintetizaram-se complexos de Cu(II) derivados do imidazole, partindo do 4-nitroimidazole, do 1-(3-aminopropil)imidazole e do benzoimidazole. Os ligandos derivados do 4-nitroimidazole e do benzoimidazole foram preparados numa sequência sintética de dois passos, a partir dos seus precursores (1-(2-bromoetil)-4-nitroimidazole e o 1-(2-bromoetil)-1H-benzoimidazole, respetivamente) sendo posteriormente reagidos com aminas. Os ligandos derivados do 1-(3-aminopropil)imidazole foram preparados por reação deste imidazole com diferentes salicilaldeídos: bromados, clorados e mono ou dissubstituídos. Os ligandos foram complexados com acetato de cobre mono-hidratado, originando os complexos de Cu(II) correspondentes.Na segunda parte do trabalho foi avaliada a atividade antitumoral dos complexos de Cu(II) sintetizados, nas quatro linhas celulares tumorais. Foi determinada a atividade metabólica das células, após tratamento com os complexos, e calculados os valores de IC50 (concentração inibitória média) a partir das curvas dose-resposta. Os complexos de Cu(II) derivados do 4-nitroimidazole e do benzoimidazole, modificados com um grupo ciclo-hexilamina, apresentaram uma maior atividade antiproliferativa, especialmente o último complexo, com valores de IC50 entre 1,2 e 6,57 µM, nas quatro linhas celulares. De salientar que estes valores de IC50, nalguns casos, são mais baixos que os obtidos para fármacos já usados na prática clínica. Em termos de relação estrutura-atividade e com base nos resultados de estudos de proliferação celular, conclui-se que a presença de um grupo ciclo-hexilamina na estrutura dos compostos poderá ser responsável pela maior atividade antitumoral dos complexos.Utilizando o complexo que apresentou melhores valores de IC50, realizaram-se estudos de viabilidade e ciclo celular. Para todas as linhas celulares, verificou-se que a viabilidade das células diminuía na presença do complexo e era acompanhada por morte celular, necrose. Avaliou-se ainda o stresse oxidativo, pela medição da produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e da produção intracelular da defesa antioxidante GSH, nas linhas celulares quimiorresistentes HCC1806 e LS1034. Aparentemente o complexo induz alterações nos níveis de ROS e GSH, que denotam a possível existência de stresse oxidativo, sendo necessário estudos mais detalhados.Adicionalmente, fizeram-se estudos de seletividade em duas linhas celulares de tecido normal, HFF1 e CCD841 CoN. Os resultados revelaram que o composto mais citotóxico possui alguma seletividade para as células tumorais, uma vez que a diminuição da viabilidade das células normais não foi tão acentuada. Foi ainda realizado um estudo de hemocompatibilidade, por quantificação da hemoglobina libertada. O estudo revelou que o composto não apresenta atividade hemolítica, uma vez que a libertação de hemoglobina foi quase nula, o que demonstra a manutenção da integridade da membrana dos eritrócitos.Com base nos resultados, o complexo de Cu(II) do benzoimidazole modificado com ciclo-hexilamina pode vir a ser promissor no tratamento do cancro, especialmente em casos de quimiorresistência.

Colorectal and breast cancer are very common and one of the main causes of mortality. Currently, in addition to the drugs used in chemotherapy treatments, such as 5-FU, irinotecan, etc., three metal complexes, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin are also used. However, these chemotherapeutic options have adverse effects and tumor cells have tendency to develop drug resistance. Thus, there is a need to develop new more effective chemotherapy agents.In previous work carried out at the Biophysics Unit of the University of Coimbra, in collaboration with the Organic group from the Department of Chemistry, 99mTc complexes modified with 4-nitroimidazole derived ligands were developed, with the purpose of being used in the detection of tumoral hypoxia. The results revealed that the complexes were able to cross the cell membrane and accumulate in tumor cells. It was hypothesized that the replacement of technetium by copper could confer cytotoxic activity to the complexes. Previous studies have revealed that Cu (II) complexes have antitumor activity, being able to cause cell death, and that some imidazoles and derivatives have pharmacological activity, including antitumor activity.In this context, this dissertation aimed at the synthesis of new Cu(II) complexes derived from imidazole and their subsequent evaluation of their antitumor activity, using in vitro tests in colorectal, LS1034 and WiDr, and breast, MCF-7 and HCC1806, cancer cell lines.Firstly, Cu (II) complexes derived from imidazole were synthesized, starting from 4-nitroimidazole, 1-(3-aminopropyl)imidazole and benzoimidazole. The 4-nitroimidazole and benzoimidazole derived ligands were prepared in a two-step synthetic sequence from their precursors (1-(2-bromoethyl)-4-nitroimidazole and 1-(2-bromoethyl)-1H-benzoimidazole, respectively) being subsequently reacted with amines. Ligands derived from 1-(3-aminopropyl)imidazole were prepared by reacting it with different salicylaldehydes: brominated, chlorinated and mono or disubstituted. The ligands were complexed with copper acetate monohydrate, yielding the corresponding Cu (II) complexes.In the second part of the work the antitumor activity of the synthesized Cu (II) complexes was evaluated in the four tumor cell lines. The metabolic activity of the cells was determined, after treatment with the complexes, and the IC50 values (mean inhibitory concentration) were calculated from the dose-response curves. The Cu(II) complexes derived from 4-nitroimidazole and benzoimidazole, modified with a cyclohexylamine group, had higher antiproliferative activity, especially the latter complex, with IC50 values between 1.2 and 6.57 μM, in the four cell lines. It should be noted that these IC50 values, in some cases, are lower than those obtained for drugs already used in clinical practice. In terms of structure-activity relationship and based on the results of cell proliferation studies, it may be concluded that the presence of the cyclohexylamine group may be responsible for the greater antitumor activity of these complexes. Viability and cell cycle studies were carried out, using the complex that presented the best IC50 values. For all cell lines, cell viability was found to decrease in the presence of the complex, resulting in cell death by necrosis. Oxidative stress was also evaluated by measuring the production of reactive oxygen species (ROS) and the intracellular production of the GSH antioxidant defense in the chemoresistant HCC1806 and LS1034 cell lines. Apparently, the complex induces changes in the ROS and GSH levels, which indicate the possible existence of oxidative stress. More detailed studies will be necessary.Additionally, selectivity studies on two normal tissue cell lines, HFF1 and CCD841 CoN, were carried out. The results revealed that the most citotoxic compound has some selectivity for tumor cells, since the decrease in viability of normal cells was not as significant. A hemocompatibility study was also done by quantification of the released hemoglobin. The study showed that the compound does not exhibit hemolytic activity, since the release of hemoglobin was almost nil, which demonstrates the maintenance of erythrocyte membrane integrity.Based on the results, the Cu(II) complex of benzoimidazole modified with cyclo-hexylamine may be promising in cancer treatment, especially in cases of chemoresistance.