The role of autophagy activation-mediated by Let-7 in a transgenic mouse model of Machado-Joseph Disease

Abstract

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa do tipo 3, é uma doença neurodegenerativa causada por uma expansão do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG) no gene MJD1, que é depois traduzida numa cadeia de poliglutaminas na proteína ataxina-3, transportando mais de 55 repetições CAG em condições patogénicas. A DMJ é a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial e caracteriza-se por vários sintomas motores e não-motores, sendo a ataxia o mais comum. Os mecanismos patogénicos subjacentes à DMJ ainda estão por esclarecer, no entanto, aceita-se que a ataxina-3 mutante ganha funções tóxicas relacionadas com a clivagem proteica, oligomerização e agregação, disfunção dos mecanismos celulares de controlo de qualidade e da desregulação a nível da transcrição e tradução, entre outras.O nosso grupo já providenciou evidências do comprometimento do mecanismo de autofagia na DMJ. Com estes estudos mostrámos que a patogénese da DMJ está associada à acumulação de autofagossomas, à diminuição de proteínas relacionadas com a autofagia, bem como à acumulação da ataxina-3 e neurodegenerescência. No entanto, a causa da desregulação da autofagia na DMJ permanece desconhecida.A autofagia é um mecanismo altamente complexo regulado por diversas moléculas, nomeadamente por microARNs (miARNs). Os miARNs, sendo pequenos ARNs não-codificantes, desempenham um importante papel regulador em células animais, tendo como alvos os transcritos de mRNA, mediando à sua clivagem ou inibição do mecanismo de tradução. Estes pequenos ARNs estão envolvidos num largo conjunto de funções biológicas, são expressos de uma forma especifica no tecido e têm sido implicados em diversas doenças incluindo doenças neurodegenerativas, particularmente em doenças de poliglutaminas. O let-7 é um miARN altamente conservado, que mostrou ter a capacidade de ativar a autofagia e melhorar a neuropatologia num modelo lentiviral da DMJ em murganho. Mais ainda, o let-7 mostrou regular diversos genes que bloqueiam o complexo mTORC1 levando à ativação da autofagia.Assim, colocámos a hipótese se o let-7 seria capaz de ativar a autofagia e consequentemente aliviar a descoordenação motora e desequilíbrio num modelo transgénico (Tg) da DMJ em murganho. Para isso, injetámos lentivírus que codificam para o let-7 ou mir-scramble (mir-scr), como controlo, no cerebelo de murganhos transgénicos da DMJ. Neste estudo, observámos que o let-7 era capaz de melhorar a coordenação motora e equilíbrio nestes animais, sendo este efeito mais evidente às 9 semanas de tratamento. Também observámos a nível neuropatológico, avaliado às 12 semanas pós-injeção, que o tratamento com let-7 levou ao aumento da espessura das camadas nos lóbulos VIII e IX e parece diminuir parcialmente o nível de agregados em todo o cerebelo. Além disto, também observámos que o modelo Tg da DMJ em murganho usado neste trabalho mostrava um comprometimento da autofagia, que foi parcialmente recuperado depois do tratamento com let-7. Na última parte deste trabalho, também observámos que a RagC, sendo um alvo do let-7, estava sobreexpressa a nível basal no modelo Tg da DMJ,, e mostrou uma tendência para estar diminuída após tratamento com let-7. Estes resultados confirmam uma vez mais que a autofagia é um bom alvo para o tratamento da DMJ. Mais ainda, este trabalho fornece novos conhecimentos acerca do papel do let-7 no contexto da DMJ e ao mesmo tempo abre novas perspetivas para uma nova abordagem possível baseada em miARNs para terapia em DMJ.

Machado-Joseph Disease (MJD), also known as Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is a neurogenerative disorder caused by an expansion of the trinucleotide cytosine-adenine-guanine (CAG) in the MJD1 gene, which translates into a polyglutamine tract within ataxin-3 protein that carries more than 55 CAG repeats in pathogenic conditions. MJD is the most common autosomal dominant ataxia worldwide and is characterized by several motors and non-motor clinical features with ataxia being the most common. Pathological mechanisms underlying MJD are still unclear, however it is accepted that mutant ataxin-3 gains toxic functions related to protein cleavage, oligomerization and aggregation, dysfunction of cellular quality control mechanisms and transcriptional and translational dysregulation, among others. Our group provided evidence of an autophagy impairment in MJD. We have shown that MJD pathogenesis is associated with accumulation of autophagosomes, decrease of autophagy-related proteins and accumulation of mutant ataxin-3 and neurodegeneration. However, the cause of autophagy deregulation in MJD remains unknown.Autophagy is a highly complex mechanism regulated by several molecules, namely by microRNAs (miRNAs). MiRNAs, being small non-coding RNAs, play an important regulatory role in animal cells by targeting mRNA transcripts for cleavage or translational repression. These small RNAs are involved in a broad range of biological functions, are expressed in a tissue specific manner and have been increasingly implicated in several disorders including neurodegenerative diseases and particularly in PolyQ diseases. Let-7 is a highly conserved miRNA, which showed to be able to activate autophagy and ameliorate neuropathology in a lentiviral- mouse model of MJD. Moreover, let-7 was shown to regulate several genes that block mTORC1 complex leading to autophagy activation.Thus, we hypothesized whether let-7 would be able to activate autophagy and consequently alleviate motor incoordination and inbalance in a Transgenic (Tg) MJD mouse model. For that, lentivirus coding for let-7 or mir-scramble (mir-scr), as a control, were injected into the cerebellum of Tg MJD mice. In this study, we observed that let-7 was able to ameliorate motor coordination and balance, being this effect more prominent after 9 weeks of treatment. We also observed at a neuropathological level, evaluated at 12 weeks post-injection, that let-7 treatment led to an increase of layers thickness in lobules VIII and IX and seemed to partially decrease the levels of aggregates in whole cerebellum. Moreover, we have also observed that the MJD Tg mouse model used in this work exhibited an impairment in autophagy that was partially rescued upon let-7 treatment. In the last part of this work, we also observed that RagC, being a let-7 target, was upregulated at a basal level in MJD Tg mice, and showed a tendency to be downregulated upon let-7 treatment. These results confirmed once more that autophagy is a good target for MJD treatment. In addition, this work provides new insights about the role of let-7 in the context of MJD and at the same time also opens new perspectives to a new possible approach based on miRNAs for MJD therapy.