Ectonucleotidases influence in Candida spp. Infections

Abstract

A incidência das infeções fúngicas tem vindo a aumentar e consequentemente as doenças causadas por fungos emergiram como sérios problemas de saúde pública. Os fungos têm diferentes mecanismos para escapar ao sistema imunitário e por isso conseguem sobreviver dentro do hospedeiro. Os neutrófilos são células do sistema imunitário cruciais e a sua libertação e recrutamento é altamente regulada. Estas células possuem várias estratégias para combater agentes patogénicos, incluindo a capacidade de fagocitar, degranular e de produzir espécies reativas de oxigénio. Em 2004, foi descrita uma nova estratégia pela qual os neutrófilos libertam redes extracelulares (Neutrophil Extracellular Traps - NETs), que consistem em cromatina descondensada extracelular com proteínas e enzimas antimicrobianas. As NETs são responsáveis por capturar, neutralizar e matar vários microrganismos. No entanto, alguns desenvolveram diferentes mecanismos de evasão das NETs, incluindo inibição da formação de NETs e digestão do DNA associado à NET pela secreção de endonucleases, permitindo assim a sua fuga ao aprisionamento ou morte por essas estruturas. Os agentes fúngicos de infeção severa, de caráter oportunista, pertencem ao género Candida. Embora Candida albicans seja o mais comum, outras leveduras têm emergido como agentes comuns de candidémia, como é o caso de Candida parapsilosis ou de Candida glabrata. Estes fungos possuem características biológicas que contribuem para a sua patogenicidade. Em particular, C. albicans tem muitos fatores de virulência que facilitam a sua patogenicidade, incluindo a secreção de enzimas hidrolíticas para o meio extracelular. C. albicans não tem uma enzima ecto-5’-nucleotidase canónica, uma vez que adicionalmente é capaz de hidrolisar 3’AMP, o que significa que, em teoria, consegue hidrolisar ácidos nucleicos. Este estudo pretendeu estudar a atividade ectonucleotidásica em C. albicans, em C. parapsilosis, em C. glabrata e em Saccharomyces cerevisiae, como um modelo de organismo “não-patogénico”. Em particular, pretendia-se estudar a relevância da atividade 3’nucleotidase/nuclease (3’NT/NU) para o escape das leveduras às NETs, e consequentemente para a sua capacidade de infeção. Neste estudo foram avaliadas a atividade 5'e 3'nucleotidase através da medição espectrofotométrica do fosfato inorgânico libertado, baseado no método de Fiske-Subbarow, e a atividade da ectonucleotidase pode ser classificada como C. albicans> C. parapsilosis> S. cerevisiae> C. glabrata. Uma vez que C. albicans foi a levedura com a maior atividade enzimática, foi a espécie selecionada para os estudos de infeção adicionais em relação à resposta de neutrófilos humanos.Ensaios de infeção usando neutrófilos humanos isolados de doadores saudáveis foram desenvolvidos e a indução de produção de NETs foi determinada por diferentes estímulos; o forbol miristato acetato (PMA), um robusto e bem estudado indutor de NETs, C. albicans e a presença de ambos os estímulos. A interação dos neutrófilos humanos com C. albicans e PMA foi analisada recorrendo à microscopia de fluorescência; a viabilidade da C. albicans foi avaliada pelo ensaio de unidades formadoras de colónias (CFU) e a viabilidade dos neutrófilos avaliada pelo ensaio com azul de tripano. Como o maior objetivo deste trabalho foi estudar se a atividade 3’NT/NU estava envolvida no seu escape das NETs, primeiro os neutrófilos humanos foram estimulados com PMA; depois os neutrófilos enriquecidos com NET foram incubados com C. albicans, pré-tratadas ou não com tetratiomolibdato de amónia (TTM), um inibidor específico da 3'NT/NU. As amostras foram analisadas por eletroforese em gel para comparar a degradação do DNA associado à NET.Os resultados obtidos mostraram que o método da sedimentação com dextrano usado para o isolamento dos neutrófilos não resultou em células ativadas. Quando C. albicans e PMA foram adicionados simultaneamente aos neutrófilos humanos, ocorreu uma maior indução de formação de NETs, uma vez que os neutrófilos produziram mais NETs nesta condição; aos 30 min de infeção já podiam ser observadas células de C. albicans aprisionadas nas NETs. Apesar do maior aprisionamento de C. albicans sob esta condição de infeção, 1 hora de infeção não diminuiu a viabilidade das leveduras em relação à observada quando C. albicans foi adicionada a neutrófilos não ativados com PMA. A eletroforese de agarose mostrou que C. albicans degrada o DNA das NETs, com ou sem tratamento com TTM, no entanto o pré-tratamento com TTM leva a um padrão diferente de distribuição do DNA no gel. Os resultados indicam que o modelo de interação dos neutrófilos e C. albicans é apropriado para o estudo do efeito da 3’NT/NU no escape à NETose.

The incidence of fungal infections has been increasing and consequently fungal diseases have emerged as serious public health problems. Fungi have different mechanisms to prevent immune capture and thus can survive within the host, escaping the response of the cells of the immune system.Neutrophils are crucial immune cells and their release and recruitment is highly regulated. These cells possess various strategies to combat pathogens, including the ability to phagocyte, to degranulate and produce reactive oxygen species (ROS). In 2004, it was described a novel strategy by which neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), that consists of extracellular decondensed chromatin decorated with antimicrobial proteins and enzymes. NETs are responsible for capturing, neutralize and kill various pathogens. However, some microorganisms have developed different NET evasion mechanisms, including inhibition of NETs formation and digestion of NET-associated DNA by secretion of endonucleases, thereby allowing their escape to trapping or killing by these structures.Fungi of the genus Candida are the most common agents of severe, opportunistic fungal infections. Although Candida albicans, is the most frequently found other species such as Candida parapsilosis and Candida glabrata, have emerged as important agents of candidaemia. These yeasts have biological traits that contribute for its pathogenesis. In particular, C. albicans has several virulence factors that facilitate its pathogenicity, including the secretion of degradading enzymes to the extracellular millieu. C. albicans do not have a canonical ecto-5'-nucleotidase enzyme, since in addition to hydrolyzing 5'AMP, it also uses 3'AMP as substrate, meaning that, in theory, it can hydrolyse nucleic acids.This work intended to study the ectonucleotidase activity of C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata and Saccharomyces cerevisiae as a “non-pathogenic” model organism. In particular, it was studied the relevance of 3'nucleotidase/nuclease (3’NT/NU) for the escape of yeasts to NETs, and consequently for their capacity of infection.In this study both 5 'and 3'nucleotidase activity were evaluated through the spectrophotometric measurement of the released inorganic phosphate, based on the Fiske-Subbarow method, and the ectonucleotidase activity can be ranked C. albicans > Candida parapsilosis > Saccharomyces cerevisiae > Candida glabrata. Since C. albicans was the yeast with the highest enzymatic activity, it was used for further infection studies regarding the response of human neutrophils.Infection assays using isolated human neutrophils from healthy donors were developed and the induction of NET production was determined by different stimuli; phorbol myristate acetate (PMA), a robust and well-studied NETs inducer, C. albicans and presence of both stimuli. The interaction of human neutrophils with C. albicans and PMA was analysed using fluorescence microscopy; C. albicans viability was assessed by a colony forming unit (CFU) assay and neutrophils viability assessed by the Trypan blue assay.As the major purpose of this work was to study if 3'NT/NU activity of C. albicans was involved in its escape from NETs, first, human neutrophils were stimulated with PMA; then NET-enriched neutrophils were incubated with C. albicans, pre-treated or not with ammonium tetrathiomolybdate (TTM), a specific inhibitor of 3'NT/NU. The samples were analysed by gel electrophoresis in order to compare the degradation of the NET-associated DNA. The results obtained showed that the Dextran sedimentation methodology used for isolation of neutrophils was suitable, not activating the cells overly. When C. albicans and PMA were added simultaneously to the human neutrophils, resulted in the highest induction of NETs formation, as neutrophils produced more NETs in this condition; at 30 min of infection there was already C. albicans cells trapped in the NETs. Despite the highest trapping of C. albicans under this infection condition, at 1 hour of infection the viability of the yeasts was similar to that observed when only C. albicans was added to the human neutrophils. Agarose electrophoresis showed that C. albicans degrades DNA from NETs, with and without treatment with TTM, however pre-treatment with TMT leads to a different pattern of DNA in the smear.The results indicate that the model of interaction of neutrophils and C. albicans is appropriate to study the effects of 3’NT/NU in the escape to NETosis.