Fetal Liver Mitochondria Alterations in an Ovine Model of Maternal Obesity

Abstract

Alterações nutricionais no ambiente intrauterino devidas à obesidade gestacional (OG) levam a alterações no metabolismo hepático fetal, predispondo a descendência a futuras doenças metabólicas, incluindo a doença do fígado gordo não alcoólico (FiGNA). No feto, em condições normais, a pressão de oxigénio do sangue no lóbulo esquerdo (ESQ) do fígado é maior do que a correspondente no lóbulo direito (DTO), resultando em perfis metabólicos distintos. Dado que a bioenergética mitocondrial desempenha um papel crucial no metabolismo e na função hepática, levantamos a hipótese de que a OG reprograma o perfil mitocondrial do fígado fetal da descendência dependendo do lóbulo. Ovelhas Rambouillet foram alimentadas com uma de duas dietas: uma dieta controlo com 100% dos requerimentos da National Research Council (NRC), (Controlo, C, n = 10), ou uma dieta materna de excesso de nutrientes com 150% dos requerimentos NRC (Obesidade Gestacional, OG, n = 8) desde 60 dias antes da conceção e durante a gravidez. Ambos os lóbulos fetais foram removidos a 0,9 do período de gestação e frações celulares ou tecido hepático foram utilizados para avaliar alguns parâmetros mitocondriais e o perfil de acetilação hepático. As atividades enzimáticas da NADH desidrogenase (CI), succinato-citocromo c-redutase (CII/III), citocromo oxidase (CIV) e citrato sintase foram medidas em mitocôndrias isoladas de fígados fetais usando ensaios colorimétricos padrão. A atividade da desidrogenase do piruvato (DP) foi avaliada usando um kit comercial. Os níveis de acetilação total foram determinados por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), seguido de Western blot e imunotransferência contra resíduos de lisinas acetiladas. O teor de proteína dos supercomplexos foi avaliado por eletroforese em condições nativas seguidas de imunoblotting. A comparação entre os grupos foi realizada pelo teste de Mann-Whitney, com significância estabelecida para p <0,05. Uma diminuição significativa nas atividades enzimáticas mitocondriais (CIV e PD) e nos níveis de MDA foram encontrados no lóbulo C DTO fetal quando comparado ao lóbulo C ESQ, uma possível indicação de uma dicotomia funcional entre os lobos hepáticos fetais. O número de cópias do mtDNA aumentou no lóbulo OG DTO fetal quando comparado com o lóbulo C DTO. Nos fetos OG, observou-se decréscimo na atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial comparativamente aos fetos C, sendo mais evidente no lóbulo ESQ, com exceção do CI, no qual foram encontradas diferenças mais significativas para o lóbulo DTO. A atividade da PD mostrou uma tendência acentuada para uma diminuição no lóbulo OG DTO (p = 0,05). Além disso, o padrão de acetilação das proteínas foi alterado, com a ausência de uma faixa de proteína acetilada aos 37 kDa na fração citosólica dos lóbulos OG DTO/ESQ e uma tendência para o aumento dos níveis de acetilação total na fração mitocondrial dos mesmos animais (p = 0,09). Em relação ao conteúdo dos supercomplexos, observou-se diminuição significativa do supercomplexo I + III2 + IV4 em ambos os lóbulos dos fetos de mães obesas. As alterações observadas na atividade das principais enzimas mitocondriais hepáticas, especialmente no lóbulo OG ESQ, sugerem alterações metabólicas hepáticas induzidas pela OG que podem ter um impacto significativo na função hepática na descendência, dependendo do lóbulo, potencialmente predispondo a doenças metabólicas, como NAFLD ou diabetes mellitus tipo II (T2DM), na vida adulta.

Conditioning of the intrauterine nutritional environment due to maternal obesity (MO) lead to alterations in fetal hepatic metabolism, predisposing offspring to later-life metabolic diseases, including non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In the fetus, the blood oxygen pressure in the left (LF) liver lobe is higher than the corresponding counterpart in the right (RT) lobe, resulting in distinct metabolic profiles. Since mitochondrial bioenergetics plays a crucial role in hepatic metabolism and function, we hypothesize that MO reprograms offspring fetal liver mitochondrial profile in a lobe-dependent manner. Rambouillet ewes were feed either a control diet with 100% of National Research Council (NRC) requirements (Control, C, n=8) or a maternal nutrient excess diet with 150% NRC requirement (Maternal Obesity, MO, n=10) from 60 days prior to conception and throughout pregnancy. Both fetal liver lobes were removed at 0.9 gestation and tissue or subcellular fractions were used to assess mitochondrial parameters and acetylome profile. The enzymatic activities of NADH dehydrogenase (CI), succinate-cytochrome c reductase (CII/III), cytochrome oxidase (CIV) and citrate synthase were measured in mitochondria isolated from fetal livers using standard colorimetric assays. Pyruvate dehydrogenase (PDH) activity was evaluated by a commercial kit. Total acetylation levels were determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western blot and immunoblotting against acetylated-lysine residues. Supercomplexes (SCs) protein content was assessed by electrophoresis in native conditions followed by immunoblotting. Comparisons between groups was performed with the Mann-Whitney test, with significance set at p<0.05. Significant decrease in mitochondrial enzymatic activities (CIV and PDH) and MDA levels were found in fetal RT C lobe when compared to the LF C lobe, a possible indication of a functional dichotomy between fetal hepatic lobes. mtDNA copy number was increased in the MO fetuses RT lobe when compared with C fetuses RT lobe. A decrease in mitochondrial respiratory chain complexes activity was observed, being more evident in the LF MO lobe, except for CI, in which differences were found for the RT MO lobe. PDH activity showed a marked tendency for a decrease in the RT MO lobe (p=0.05). Additionally, the protein acetylation pattern was found to be altered, with the absence of a ≈37 kDa acetylated protein band in the cytosolic fraction of RT/LF MO lobes and a non-statistically significant increase in total acetylation levels in the mitochondrial fraction (p=0.09). Regarding SCs content, a significant decrease in SC I+III2+IV4 was observed in RT/LF MO lobes. The observed differences in the activity of key hepatic mitochondrial bioenergetics enzymes, especially in the LF MO lobe, suggest hepatic metabolic remodeling induced by MO that may have a significant impact offspring liver function in a lobe-dependent manner, potentially predisposing to metabolic diseases, such as NAFLD or type II diabetes mellitus (T2DM), in adulthood.