Rádio-223 no tratamento do carcinoma da próstata metastático: estudo dos efeitos em linhas celulares normais

Abstract

O cancro da próstata é o segundo tipo de neoplasia mais frequente em homens a nível mundial e a quinta causa de morte relacionada com o cancro. Nos países mais desenvolvidos, o cancro da próstata é o tipo de cancro mais frequente em homens. A terapia hormonal por privação de androgénios (ADT) tem sido aceite como o tratamento standard para o carcinoma da próstata; no entanto, apesar de se observar uma resposta inicial favorável, muitas vezes esta é de curta duração. A fase da doença em que não ocorre resposta à terapêutica por castração e quando simultaneamente surgem metástases ósseas designa-se por cancro da próstata metastático resistente à castração (CPMRC), verificando-se um alto índice de mortalidade. O radiofármaco Rádio-223 (223Ra) surge como alternativa terapêutica por apresentar eficácia comprovada no aumento do tempo médio de sobrevida do doente, formando complexos com a hidroxiapatite em áreas de remodelação óssea.O objetivo primordial deste projeto foi compreender os efeitos do 223Ra numa linha celular normal, não tumoral, e realizar testes complementares de modo a comparar os resultados obtidos entre as células tumorais e as células normais.Numa primeira fase desta dissertação avaliou-se a cinética do 223Ra numa linha normal do epitélio da próstata, a linha RWPE-1, através da realização dos estudos de captação. De seguida estudou-se os efeitos nas três linhas celulares ao nível da proliferação celular, com recurso ao ensaio SRB, e da sobrevivência celular, obtendo os fatores de sobrevivência celular através do ensaio clonogénico. Os efeitos do 223Ra foram igualmente estudados a nível morfológico através do método de coloração May-Grünwald Giemsa e por fim desenvolveu-se e foi otimizado um protocolo de obtenção de estruturas tridimensionais de células, sujeitando-as aos efeitos do 223Ra. Os efeitos foram estudados recorrendo ao ensaio de morfologia. Verificou-se que existe captação de 223Ra por parte das células da linha RWPE-1, sendo, no entanto, inferior comparativamente com as linhas celulares tumorais. Através do ensaio SRB, 48 horas após a irradiação, na linha celular RWPE-1 não ocorreu alterações na proliferação celular comparativamente com as linhas celulares tumorais PC3 e LNCaP, que sofreram uma diminuição da proliferação com o aumento da dose. No entanto, no ensaio SRB 8 dias após a irradiação, a linha celular RWPE-1 sofreu uma diminuição na proliferação celular comparativamente com as linhas celulares PC3 e LNCaP. Estes dados são corroborados pelo ensaio clonogénico, pois também se verifica uma diminuição do fator de sobrevivência para a linha celular RWPE-1. A análise da morfologia revelou evidências de necrose para as linhas celulares tumorais, 48 horas após a irradiação, sendo que para a linha celular RWPE-1 não são visíveis aspetos típicos de morte celular. Estes dados corroboram os resultados obtidos no ensaio SRB realizado 48 horas após a exposição ao 223Ra.Os ensaios preliminares realizados com o objetivo de obter culturas 3D da linha celular tumoral PC3 através do método de levitação magnética foram bem-sucedidas, tendo-se obtido culturas com organização espacial esférica, conferindo-lhes um aspeto tridimensional. Na análise morfológica não foram visíveis os aspetos morfológicos de morte celular esperados.Assim, com este trabalho foi possível concluir que o 223Ra apresenta maior seletividade para as linhas tumorais do que para as células normais, e que o seu efeito aumenta com o aumento da dose e também com o tempo após a irradiação. No que diz respeito às culturas 3D de células tumorais de cancro da próstata foi possível estabelecer um protocolo de execução capaz de ser reprodutível em ensaios futuros.

Prostate cancer is the second most common form of neoplasm in men worldwide and the fifth leading cause of cancer-related death. In developed countries, prostate cancer is the most common type of cancer in men. Androgen deprivation hormone (ADT) therapy has been accepted as the standard treatment for prostate carcinoma; however, despite the favorable initial response which can be observed, it is often short-lived. The stage of the disease in which there is no response to castration therapy and when bone metastases occur simultaneously is called castration-resistant metastatic prostate cancer (CPMRC), with a high mortality rate. The Radium-223 (223Ra) is a therapeutic alternative because it has proved effective in increasing the patient average survival time, forming complexes with hydroxyapatite in areas of bone remodeling.The primary objective of this project was to understand the effects of 223Ra on a normal, non-tumor cell line and to perform complementary tests to compare the results obtained between tumor cells and normal cells.In a first part of this dissertation, the kinetics of 223Ra were evaluated in a normal cell line of prostate epithelium, the RWPE-1 cell line, through the uptake studies. The effects on the three cell lines at the level of cell proliferation, using the SRB assay, and cell survival, were then studied, obtaining the cell survival factors through the clonogenic assay. The effects of 223Ra were also studied at the morphological level through the method of staining May-Grünwald Giemsa and finally a protocol for obtaining three-dimensional cell structures was developed to study 223Ra effects using morphology assay.223Ra uptaked by RWPE-1 cells was lower compared to tumor cell lines. Through the SRB assay, 48 hours after irradiation, in the RWPE-1 cell line there were no changes in cell proliferation compared to the PC3 and LNCaP tumor cell lines, which underwent a decrease in proliferation with increasing radiation dose. However, in the SRB assay 8 days after irradiation, the RWPE-1 cell line suffered a decrease in cell proliferation compared to the PC3 and LNCaP cell lines. These data were corroborated by the clonogenic assay, in which there was also a decrease in the survival factor for the RWPE-1 cell line.Morphology analysis revealed evidence of necrosis for tumor cell lines 48 hours after irradiation, and typical aspects of cell death are not visible for the RWPE-1 cell line. These data corroborate the results obtained in the SRB assay performed 48 hours after exposure to 223Ra.Preliminary tests performed with the objective of obtaining 3D cultures of the PC3 tumor cell line through the magnetic levitation method were successful, obtaining cultures with spherical spatial organization, giving them a three-dimensional appearance. In the morphological analysis the morphological aspects of expected cell death were not visible.Thus, with this work it was possible to conclude that 223Ra presents greater selectivity for tumor lines than for normal cells, its effect increases with increasing dose and with time after irradiation. With respect to 3D cultures of prostate cancer tumor cells it has been possible to establish an implementation protocol capable of being reproducible in future lab experiences.