Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/83716
Title: Pre-miR-29 as a lung cancer biopharmaceutical: a new approach for its purification and delivery with functionalized nanoparticles.
Other Titles: Pre-miR-29 como um biofármaco para o cancro do pulmão: nova abordagem para sua purificação e entrega com nanopartículas funcionalizadas
Authors: Barreira, Maria Luís Martins 
Orientador: Figueiras, Ana Rita Ramalho
Sousa, Fani Pereira de
Keywords: Cancro do Pulmão; Produção Recombinante; Pre-miR-29 humano; Cromatografia de Afinidade; Poliplexos; Lung Cancer disease; Recombinant Production; pre-miR-29; Affinity Chromatography; Polyplexes
Issue Date: 13-Oct-2017
Serial title, monograph or event: Pre-miR-29 as a lung cancer biopharmaceutical: a new approach for its purification and delivery with functionalized nanoparticles.
Place of publication or event: Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
Abstract: O cancro do pulmão tem sido, desde há várias décadas, o tumor mais frequente do mundo, representando 13% dos novos casos de cancro anualmente em Portugal. A baixa eficiência dos tratamentos convencionais, devido à reduzida especificidade e acumulação de fármacos nos tumores, levou ao interesse em explorar novas estratégias terapêuticas. A terapia génica, aliada com a nanotecnologia, é uma das áreas mais extensas de investigação para o cancro do pulmão, em que o principal objetivo é desenvolver um tratamento seguro e eficiente, através da marcação específica e eliminação de células cancerígenas. Os microRNAs (miRNAs) têm surgido com a possibilidade de serem usados como biofármacos para o tratamento de diversas doenças, incluindo cancro do pulmão. Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que modulam, activamente, os processos fisiológicos das células como a apoptose, o controlo do ciclo e proliferação celular, reparação do DNA e metabolismo. A família do miR-29 (29a, 29b, 29c) possui complementaridade para as regiões 3'UTR das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, que são proteínas-chave envolvidas na metilação do DNA, frequentemente desreguladas no cancro do pulmão de não-pequenas células. Assim, tornou-se necessário investigar a relação do pre-miR-29 na regulação dos níveis das DNMTs, uma vez que permitem normalizar os padrões de metilação. Neste trabalho, a produção do pre-miR-29 humano baseou-se na produção recombinante, utilizando o hospedeiro bacteriano Escherichia coli (E. coli) DH5a. Posteriormente, desenvolveu-se uma estratégia de purificação, baseada em cromatografia de afinidade, utilizando uma matriz de arginina superporosa, para purificar o pre-miR-29. Para a entrega do pre-miR-29 nas células cancerígenas e, para permitir alguma protecção da biomolécula, foi avaliada a possibilidade de encapsular o pre-miR-29 numa nanopartícula. Para isso, foram desenvolvidos e caracterizados sistemas de entrega não-virais, como sistemas poliméricos (poliplexos). As formulações foram preparadas com polímeros biodegradáveis, Polietilenimina (PEI) e Quitosano (CS), que demonstraram elevada eficiência de encapsulação, tamanhos pequenos e exibiram uma forte carga positiva na sua superfície. Além disso, a funcionalização destes sistemas de entrega com a lactoferrina (Lf), um ligando específico, permitiu melhorar o reconhecimento das partículas pelos receptores que se encontram na superfície apical das células epiteliais brônquicas. Por fim, avaliou-se a actividade celular do pre-miR-29 recombinante na inibição da expressão de DNMT1, através da técnica de RT-qPCR. Os resultados indicaram que, o pre-miR-29 representa um produto biofarmacêutico promissor para a modulação terapêutica dos níveis de DNMT1 uma vez que, se obteve uma inibição da expressão proteica de cerca de 36% usando o poliplexo PEI-SA-Lf e 49% para o CS-SA-Lf. Esta regulação da DNMT I, poderá ser um indicador da possibilidade de restabelecer a expressão de genes supressores tumorais silenciados pela metilação, como o FHIT e WWOX e, assim, inibir a tumorigenicidade in vitro.
Lung cancer has been the most frequent tumor in worldwide for several decades and represents 13% of new cases of cancer annually in Portugal. The low efficiency of conventional treatments, due to the low specificity and accumulation of drugs in tumors has led to the development of new therapeutic strategies. The targeted gene therapy allied with nanotechnology is one of the most extensive area of lung cancer research, where the crucial aim is to develop safe and effective treatment through specific targeting and elimination of cancer cells. The hypothesis that microRNAs (miRNAs) can be used as biopharmaceuticals has been emerging for treatment of incurable diseases, including lung cancer. MiRNAs are small noncoding RNAs which actively modulate cell physiological processes as apoptosis, cell cycle control, cell proliferation, DNA repair, and metabolism. The miR-29 family (29a, 29b, 29c) has complementarities to the 3'UTRs of DNA methyltransferase (DNMT) 1, 3A and 3B, which are key proteins involved in DNA methylation, frequently up-regulated in non-small-cell lung cancer and associated with poor prognosis. Thus, it is necessary to investigate the role of pre-miR-29 in regulation of DNMTs levels, which could normalize the aberrant patterns of methylation. In this present work, the human pre-miR-29 production was based in recombinant production, using the bacterial host Escherichia coli (E. coli) DH5α. Afterwards, it was studied a purification strategy, based on affinity chromatography, using a superporous arginine matrix, to purify the pre-miR-29. For the delivery to lung cancer cells and to provide some protection to the target molecule, it was evaluated the possibility to encapsulate the pre-miR-29 into a nanoparticle. For this purpose, non-viral delivery systems, such as polymeric systems (polyplexes), were developed and characterized. The formulations were prepared with biodegradable polymers, namely polyethylenimine (PEI) and chitosan (CS), which demonstrated high loading capacity, small sizes and exhibited a strong positive charge on their surface. Further, the functionalization of these delivery systems with a specific ligand, lactoferrin (Lf), was performed to improve the particle recognition by the receptors on the apical surface of bronchial epithelial cells. Finally, the cellular activity of the recombinant pre-miR-29 at inducing translation inhibition of DNMT1 was evaluated using RT-qPCR. The results indicate that recombinant pre-miR-29 can represent a promising biopharmaceutical product for the therapeutic modulation of human DNMT1 levels, because it was achieved an inhibition of the protein expression of about 36% for the PEI-SA-Lf and 49% for CS-SA-Lf. This regulation of DNMT I, can also induce the re-establishment of methylation-silenced tumor suppressor genes expression, such as FHIT and WWOX, and thus inhibiting tumorigenicity in vitro.
Description: Dissertação de Mestrado em Tecnologias do Medicamento apresentada à Faculdade de Farmácia
URI: https://hdl.handle.net/10316/83716
Rights: openAccess
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