Unravelling the function of Oct4 via its acute depletion in embryonic stem cells

Abstract

Naïve pluripotency is a cell state acquired in mammalian development during epiblast formation, in the pre-implantation embryo. It is characterized by the unbiased potential to make all lineages of the adult organism and can be captured in in vitro culture as embryonic stem cells. Oct4, one of the archetypal reprogramming factors, regulates the naïve network and lineage commitment in a defined-level manner. Naïve pluripotent stem cells cannot maintain their identity without Oct4. Although this factor has been extensively studied, the mechanism behind its action is still poorly understood. This is mainly due to the lack of a system to delete Oct4 protein rapidly. In this study, a novel system is used for the depletion of Oct4 protein in a rapid and efficient manner in mouse embryonic stem cells. I characterize this system for the first time, demonstrating depletion of Oct4 by 2h without exhibiting an Oct4-low state, and use it to explore the roles of Oct4 in the transcriptional and epigenetic regulation of naïve identity. I observed that Oct4 depletion leads to immediate changes in histone modifications and non-coding RNA expression prior to the appearance of pronounced transcriptional changes. Moreover, transcription of pluripotency genes can occur in the absence of Oct4 protein in on short timescales. In the long term, cells follow a trajectory toward TE identity upon loss of Oct4, but the increase in expression of TE-related genes does not occur earlier than 24h after Oct4 depletion. Overall, in this work I describe for the first time a direct molecular mechanism of the action of Oct4 in naïve pluripotency maintenance, shedding light in the mystery of how this crucial factor acts to instruct cell identity.

A pluripotência naïve é um estado celular que ocorre durante o desenvolvimento dos mamíferos aquando da formação do epiblasto do embrião pré-implantação. Este estado caracteriza-se pela capacidade, sem qualquer viés, de originar todas as linhagens celulares do organismo adulto e pode ser capturado em cultura in vitro na forma de células estaminais embrionárias. O Oct4, um dos principais factores de reprogramação, regula a identidade naïve e a transição para diferenciação, de forma dependente do seu nível de expressão. As células estaminais pluripotentes naïve são incapazes de manter a sua identidade na ausência do Oct4. Embora este factor tenha sido amplamente estudado, os mecanismos subjacentes à sua acção são ainda desconhecidos. Este facto pode ser explicado, principalmente, pela inexistência, até à data, de um sistema capaz de eliminar rapidamente a proteína Oct4. Neste estudo, é usado um novo sistema para induzir a degradação da proteína Oct4 de forma rápida e eficiente em células estaminais embrionárias de ratinhos. Este sistema é caracterizado pela primeira vez neste trabalho, demonstrando a degradação do Oct4 ao fim de 2h, sem passar por um estado de reduzida expressão de Oct4, e é usado para explorar o papel do Oct4 na regulação transcricional e epigenética da identidade naïve. Foi possível observar que a degradação do Oct4 induz alterações imediatas nas modificações de histonas e na expressão de RNA não codificante, que ocorrem previamente ao aparecimento de mudanças acentuadas na transcrição. Além disso, a transcrição de genes marcadores de pluripotência pode ocorrer na ausência da proteína Oct4 a curto prazo. A longo prazo, as células seguem uma trajetória em direcção à identidade de trofectoderme, mas o aumento na expressão de genes associados à trofectoderme não ocorre antes das 24h após a degradação do Oct4. Em conclusão, neste trabalho descrevo pela primeira vez um mecanismo molecular directo da acção do Oct4 na manutenção da pluripotência naïve, ajudando a clarificar de que forma este factor crucial contribui para estabelecer a identidade celular.