Behavioral and Biochemical Characterization of Stargazin knock-in mice expressing an Intellectual disability-linked mutation.

Abstract

A plasticidade sináptica que ocorre ao nível das sinapses excitatórias é um dos mecanismos cerebrais mais importantes para um normal desenvolvimento da nossa capacidade intelectual, sendo essencial para todas as funções cognitivas. O glutamato é o neurotransmissor mais abundante no sistema nervoso central e o principal mediador da neurotransmissão excitatória. A ação deste neurotransmissor é dependente da sua ligação a recetores na membrana pós-sináptica, podendo atuar em dois tipos de recetores: inotrópicos, que quando ativos permitem a passagem de iões como Na+, K+ e Ca2+; e metabotrópicos, cuja função é ativar cascatas de proteínas intracelulares. A ação conjunta destes recetores modula o funcionamento de grande parte dos circuitos neuronais essenciais para as funções cognitivas. Assim, todos os constituintes do complexo sistema que forma as sinapses gluatamatérgicas desempenham um papel essencial nas regiões cerebrais que maioritariamente regulam a capacidade de aprendizagem e formação de memórias, tais como o hipocampo, o córtex pré-frontal e o cerebelo.Os recetores ionotrópicos de glutamato do tipo AMPA são os principais mediadores da neurotransmissão excitatória rápida. A eficiência da transmissão glutamatérgica é dependente do padrão de atividade neuronal, podendo ser reforçada ou enfraquecida dependendo da quantidade de recetores na membrana celular sináptica, fenómeno designado de plasticidade sináptica. Os recetores AMPA interagem com várias proteínas que influenciam a sua funcionalidade. Entre estas destaca-se a família de proteínas chamadas TARP (proteínas transmembranares associadas aos recetores AMPA). Estas proteínas regulam a atividade dos recetores a vários níveis, tais como modulando o seu tráfego sináptico e as propriedades biofísicas do canal iónico dos recetores. Dentro desta família de proteínas, a stargazina é a mais conhecida e uma das mais abundantes. Esta proteína tem como principal função estabilizar os recetores na membrana sináptica, de forma dependente da sua interação com a PSD95. Tendo em conta o seu importante papel na regulação da atividade dos recetores AMPA, a stargazina é essencial para o correto funcionamento dos processos de plasticidade sináptica. Esta proteína é codificada pelo gene CACNG2, e murganhos que possuem uma forma corrompida deste gene (murganhos stargazer) têm uma redução dramática na atividade neuronal dependente dos recetores AMPA nas regiões cerebrais onde a proteína é mais abundante.Vários estudos anteriores têm sugerido que a disfunção das sinapses glutamatérgicas está implicada em vários distúrbios psiquiátricos e do desenvolvimento, tais como o défice cognitivo, distúrbios do espectro autista e esquizofrenia. A anormal funcionalidade destas sinapses é frequentemente associada a anormalidades nas proteínas sinápticas como as TARPs. Este projeto teve como objetivo estudar uma mutação (p. Val143Leu) no gene CACNG2 que foi identificada numa criança com défice cognitivo. Um estudo anterior revelou que esta mutação diminui na capacidade da stargazina para interagir com os recetores AMPA, levando a uma diminuição dos níveis dos recetores na sinapse em neurónios transfetados para expressarem esta forma mutada. Foi criado pelo nosso laboratório um modelo animal de murganho geneticamente modificado que expressa a stargazina mutada (stargazina V143L). O estudo aqui apresentado descreve a caracterização deste animal modelo, ao nível da composição bioquímica das sinapses, morfologia dos neurónios do hipocampo e comportamento social, realizada com o intuito de tentar perceber de que forma a mutação na stargazina altera a capacidade funcional da proteína e como pode levar a um fenótipo característico de distúrbios como o défice cognitivo. Descobrimos que os neurónios da região CA1 do hipocampo destes animais têm uma arborização dendrítica de complexidade reduzida, bem como uma redução no tamanho das suas dendrites. Para além disso observámos que a forma mutada da stargazina se encontra menos expressa na sinapse. Finalmente, verificamos que estes animais exibem um comportamento social anormal e alterações no comportamento perseverante de ocultação de objetos, típico dos murganhos. Concluindo, este estudo demonstra uma relação de causalidade entre a mutação V143L na stargazina, detetada num doente com défice intelectual, e alterações na morfologia neuronal no hipocampo e no comportamento social de murganhos. Contudo, é necessária uma análise mais aprofundada de modo a perceber em que medida é que esta mutação afeta a função da stargazina, levando consequentemente a alterações nos circuitos neuronais que regulam os comportamentos afetados nos animais. Com os resultados provenientes destas análises esperamos perceber melhor como alterações genéticas desta ordem levam a este tipo distúrbios cognitivos. A plasticidade sináptica que ocorre ao nível das sinapses excitatórias é um dos mecanismos cerebrais mais importantes para um normal desenvolvimento da nossa capaci

The plasticity of excitatory synapses is an essential brain process involved in cognitive functions and necessary for the proper development of intellectual capacities. Glutamate, the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system, acts on ionotropic and metabotropic receptors. Together and distinctly, these receptors modulate neuronal circuits that underlie aspects of cognitive function. Therefore, glutamatergic synaptic transmission is a key player in learning and memory formation processes in brain areas such as the hippocampus, the prefrontal cortex and the cerebellum.Within glutamatergic synapses AMPA receptors (AMPARs) mediate most of the rapid excitatory neurotransmission and undergo activity-dependent changes in their trafficking and surface expression, which have been proven to be fundamental mechanisms for synaptic plasticity processes such as long-term potentiation (LTP). An increase in the post-synaptic response to a stimulus is achieved either through elevating the number of AMPARs at the post-synaptic surface or by increasing the single channel conductance of these receptors. The ability to control the surface expression and activity of AMPARs is also essential for homeostatic plasticity, a set of mechanisms that act in order to stabilize neuronal and circuit activity by counterbalancing some of the plastic challenges faced by neurons. AMPARs directly interact with transmembrane AMPA receptor regulator proteins (TARPs), which act as their auxiliary subunits. TARPs influence AMPAR synaptic targeting, synapse expression and function by different mechanisms. Among the TARPs, stargazin (γ-2) is one of the most important and abundant members of this family. This protein regulates AMPA receptor function and stabilizes AMPARs in the synaptic membrane due to a strong interaction with PSD-95; consequently, it plays a crucial role in synaptic plasticity. Stargazin is encoded by the human CACNG2 gene, and mice in which the homologous gene is disrupted (stargazer mice) show a dramatic loss of AMPA receptor activity in brain regions where stargazin is highly expressed.A significant amount of previous studies suggest that the dysfunction of glutamatergic synapses is strongly implicated in several neurodevelopmental disorders, such as Intellectual disability (ID), autism spectrum disorders and schizophrenia. The disruption of glutamatergic synapses is often related with the dysfunction of synaptic scaffold proteins or TARPs. In this study, we looked into a de novo mutation (p. Val143Leu) in the CACNG2 gene that was identified in a male with moderate ID. A previous study showed that this mutation significantly decreases stargazin's ability to bind to AMPARs and reduces cell surface expression of the GluA1 AMPAR subunit in transfected hippocampal neurons and HEK293 cells. In order to elucidate how this mutation affects protein function and contributes to the development of disease-associated phenotypes our laboratory generated a knock-in mouse harboring the human mutation in the stargazin-encoding gene. In this project, we characterized the synaptic biochemical composition, hippocampal neuronal morphology and social behavior featured by these mice, to address the role of stargazin in normal neuronal development and to determine causality between a disease-associated mutation in the CACNG2 gene and the generation of ID-like behavior in mice. Here, we found that mutant stargazin levels are decreased at whole-brain derived postsynaptic densities, but found no evidence for alterations in AMPARs subunits synaptic expression. Remarkably, neuronal morphology analyses revealed that stargazin V143L+/+ knock-in mice CA1 pyramidal neurons exhibit decreased dendritic arborization complexity and a decrease in the total length of dendrites. Finally, stargazin V143L+/+ knock-in mice displayed abnormal social behavior in the three chamber test and impairment in the perseverative species-typical burying behavior.In conclusion, this study revealed that the altered form of stargazin, resultant from the V143L mutation in the CACNG2 gene, is indeed causative of morphological and behavioral abnormalities in mice. Further analyses are needed to complete the characterization of this mouse model and to better understand to what extent the ID-associated mutation affects stargazin function, and leads to neuronal circuits alteration that underlie the behavior impairments reported in this study. Ultimately, we hope that the knowledge resulting from the study of these mice gives us valuable insights to understand the big picture of the stargazin-associated disorders and other similar conditions.The plasticity of excitatory synapses is an essential brain process involved in cognitive functions and necessary for the proper development of intellectual capacities. Glutamate, the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system, acts on ionotropic and metabotropic receptors. Together and distinctly, these r