Avaliação da toxicidade de um efluente municipal como uma contribuição para a validação de um ensaio alternativo ao teste letal com peixes

Abstract

A ciência tem sugerido inúmeras estratégias para o desenvolvimento de ensaios alternativos ao uso de peixes em ecotoxicologia aquática. No entanto, a maior parte dos estudos diz respeito à comparação da toxicidade de substâncias ativas de fármacos e pesticidas e trabalhos com amostras recolhidas em meio natural, como sejam os efluentes, têm sido esquecidos. Deste modo, este projeto de mestrado pretende contribuir para a validação de um ensaio in vitro alternativo ao uso de peixes em ensaios letais para estimar a toxicidade aquática de um efluente municipal. O trabalho científico teve como principal objetivo comparar os resultados da caracterização química de amostras que representam um gradiente natural de um efluente municipal com os resultados de citotoxicidade obtidos usando a linha celular H9c2. Para se chegar ao objetivo principal foram delineados vários objetivos específicos: 1) definir qual o efluente municipal a estudar; 2) caracterizar quimicamente o gradiente natural do efluente municipal definido em 1; 3) desenvolver ensaios de toxicidade com a linha celular H9c2 usando as amostras definidas em 1 e, 4) relacionar os resultados de toxicidade obtidos em 3 com a caracterização química feita em 2.A área de estudo escolhida foi um troço do rio Mondego, junto à cidade de Coimbra, onde foram recolhidas quatro amostras de água superficial, e a ETAR do choupal, responsável pelo tratamento do efluente municipal da cidade, onde foi recolhida uma amostra de efluente, imediatamente antes da sua descarga em meio recetor, o rio Mondego. As quatro amostras recolhidas no rio Mondego englobam uma amostra considerada de referência por ter sido recolhida a montante da descarga do efluente, junto à ETA da cidade de Coimbra; uma amostra recolhida em meio recetor junto à descarga do efluente; e duas amostras recolhidas a 300 e 600 metros a jusante da descarga do efluente. Além dos parâmetros sílica, condutividade elétrica, dureza total e fosfatos, os parâmetros físico-químicos analisados foram alguns dos recomendados pela Diretiva Quadro de Água e listados no Anexo XVIII e Anexo XXI do Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto: temperatura, oxigénio dissolvido, taxa de saturação de oxigénio, carência química de oxigénio, carência bioquímica de oxigénio, pH, sólidos suspensos totais, nitratos, azoto amoniacal, azoto total e fósforo total. Uma vez que a ETAR escolhida recebe águas residuais de um Hospital Central, também se recorreu à análise em HPLC com detecção por DAD para a quantificação de alguns compostos orgânicos específicos, a carbamazepina e o sulfametoxazol.A caracterização físico-química das amostras analisadas mostrou para a maioria dos parâmetros o seguinte gradiente: Referência → 600 metros → 300 metros → Meio Recetor → Efluente. No entanto, os resultados de toxicidade ao nível da célula só conseguiram discriminar as amostras com maior evidência de contaminação (Efluente, Meio Recetor e 300 metros) das potencialmente menos contaminadas (Referência e 600 metros).

The science has been suggested innumerable strategies for the development of alternative assays to replace standard fish lethality tests in aquatic ecotoxicology. However, most of the studies compare the toxicity of active substances of drugs for human use or pesticides, and studies with effluent samples have been forgotten. Thus, this master's project intends to contribute for the validation of an alternative in vitro assay for the regulatory fish lethal test by estimating the aquatic toxicity of a municipal effluent. The main objective of this scientific study was to compare the results of the chemical characterization of samples representing a natural gradient of a municipal effluent with the cytotoxicity results obtained using the H9c2 cell line. In order to achieve this main goal, several specific objectives were outlined: 1) defining which municipal effluent to study; 2) characterizing chemically the natural gradient of the municipal effluent defined in 1; 3) developing toxicity tests with the H9c2 cell line using the samples defined in 1, and 4) linking the toxicity results obtained in 3 with the chemical characterization made in 2.The study area chosen was a section of the Mondego River, near the city of Coimbra, where four samples of surface water were collected, and the WWTP of the Choupal, which is responsible for the treatment of the municipal effluent from the city, where an effluent sample was collected, immediately before being discharged into the effluent receiving water, the Mondego River. The four samples collected in the Mondego River include the reference sample since it was collected upstream the effluent discharge point, near the ETA of the city; a sample collected in the effluent receiving water next to the discharge of the effluent; and two samples collected at 300 and 600 meters downstream from the effluent discharge. Besides to the parameters silica, electrical conductivity, total hardness and phosphates the physicochemical parameters analyzed were some of those recommended by the Water Framework Directive and listed in Annex XVIII and Annex XXI of Decree-Law 236/98 of 1 August: temperature, dissolved oxygen, oxygen saturation rate, chemical oxygen demand, biochemical oxygen demand, pH, total suspended solids, nitrates, ammoniacal nitrogen, total nitrogen and total phosphorus. Since the chosen WWTP receives waste water from a Central Hospital, it was also used HPLC analysis with DAD to quantify of some specific organic compounds, carbamazepine and sulfamethoxazole.The physical-chemical characterization of the analyzed samples showed for the majority of parameters the following gradient: Reference → 600 meters → 300 meters → effluent receiving water → effluent. Regarding the cell toxicity results, it can only discriminate the samples with the highest contamination level (effluent, receiving medium and 300 meters) from the potentially least contaminated (reference and 600 meters).