The potential therapeutic effect of heat shock protein 90 inhibition in chronic myeloid leukemia

Abstract

A Proteína de Choque Térmico 90 (HSP90) facilita a maturação, estabilidade, atividade e enrolamento intracelular de mais de 200 proteínas, designadas “proteínas clientes”. Nas células cancerígenas, a HSP90 ajuda a superar múltiplos stresses ambientais, incluindo instabilidade genómica/aneuploidia, stress proteotóxico, necessidades nutricionais aumentadas, níveis de oxigénio reduzidos, e ajudam na evasão ao sistema imune. Uma das proteínas clientes da HSP90 é a proteína BCR-ABL, uma oncoproteína responsável pela Leucemia Mieloide Crónica (LMC). A Alvespimicina (17-DMAG) é um inibidor da HSP90 que tem melhores propriedades farmocinéticas e menos efeitos secundários comparando com outras ansamicinas benzoquinonas. Este trabalho tem por objetivo o estudo dos efeitos do 17-DMAG em linhas celulares de LMC (sensível e resistentes ao Imatinib) e explorar o papel da família das HSP na sensibilidade ao Imatinib. Neste contexto, utilizámos três linhas celulares de LMC: a linha K562, sensível ao Imatinib, e as linhas K562-RC e K562-RD, resistentes ao Imatinib. As células foram incubadas na ausência e na presença de concentrações crescentes de 17-DMAG (de 1 a 1000 nM) em administração única. As curvas dose-resposta foram determinadas pelo teste da resazurina. A morte celular foi determinada por microscopia (coloração May-Grunwald Giemsa) e por citometria de fluxo (CF), usando dupla fixação de Anexina V e Iodeto de Propídeo (IP). A sonda Apostat foi usada para avaliar os níveis de expressão das caspases e a sonda JC-1 para determinar o potencial de membrana mitocondrial por CF. O ciclo celular foi avaliado por CF, usando o teste PI/RNase. Os níveis de expressão proteica da família das HSP foram analisados por western blot. Os nossos resultados mostraram que o 17-DMAG induz uma redução da atividade metabólica das linhas celulares, dependente do tempo, da dose e da linha celular, com um IC50 de 50 nM para as células K562 e inferior a 50 nM para as células K562-RC e K562-RD, após 48 horas de tratamento. Este composto induz morte celular predominantemente por apoptose, confirmado pela análise morfológica, CF, e pelo aumento da razão JC-1 Monómeros/Agregados. A análise do ciclo celular mostrou que o 17-DMAG induz bloqueio do ciclo celular em G0/G1 nas células K562 e K562-RC e em G2/M nas células K562-RD. A análise proteica das HSP mostrou que as células K562 têm ligeiramente mais expressão de HSP90 que K562-RC e K562-RD e o tratamento de 17-DMAG induziu um aumento significativo da expressão de HSP70. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a inibição de HSP90 pelo 17-DMAG poderá constituir uma potencial nova abordagem terapêutica da LMC, mesmo em casos de resistência ao Imatinib.

Heat Shock Protein 90 (HSP90) facilitates the maturation, stability, activity and intracellular folding of more than 200 proteins, called 'client proteins'. In cancer cells, HSP90 helps to overcome multiple environmental stresses, including genomic instability/aneuploidy, proteotoxic stress, increased nutrients demand, reduced oxygen levels, and to prevent destruction by the immune system. One of these client proteins of HSP90 is BCR-ABL, the oncoprotein responsible for Chronic Myeloid Leukemia (CML). Alvespimycin (17-DMAG) is a HSP90 inhibitor that has better pharmacokinetic properties and fewer side-effects compared to others benzoquinone ansamycins. This work aims to study the potential therapeutic effect of 17-DMAG in CML cell lines (sensitive and resistant to imatinib) and to explore the role of HSP family in the sensitivity to Imatinib. In this context, we used three CML cell lines: the K562 cells, sensitive to Imatinib, and the K562-RC and K562-RD cells, resistant to Imatinib. Cells were incubated in the absence and presence of increasing concentrations of 17-DMAG (from 1 to 1000 nM) in single dose. The dose-response curves were determined by the resazurin assay. Cell death was determined through microscopy (May-Grunwald Giemsa staining) and flow cytometry (FC), using Annexin V and Propidium Iodide (PI) double staining. The Apostat Probe was used to evaluate caspase expression levels and the JC-1 probe to determine the mitochondrial membrane potential, through FC. Cell cycle was evaluated with FC, using PI/RNase assay. The protein expression levels of HSP family were assessed with western blot. Our results showed that 17-DMAG induces a reduction in cell lines metabolic activity in a time, dose and cell type dependent manner, with an IC50 of 50 nM for K562 and less than 50 nM for the K562-RC and K562-RD cell lines, after 48 hours of treatment. This compound induces cell death predominantly by apoptosis, confirmed through morphological analysis, FC and by the increase in JC-1 Monomers/Aggregates ratio. Apart from the cytotoxic effect, the cell cycle analysis showed that 17-DMAG induces cell cycle arrest in G0/G1 for K562 and K562-RC, and in G2/M for K562-RD. The HSP protein analysis showed that K562 have slightly more expression of HSP90 than K562-RC and K562-RD cells and the treatment with 17-DMAG induced a significant increase in HSP70 expression. In conclusion, our results suggest that inhibition of HSP90 by 17-DMAG could be used as a new potential approach in the treatment of CML, even in cases of Imatinib resistance.