Identification of the toxic fragment of ataxin-3 protein in Machado-Joseph disease

Abstract

A doença de Machado-Joseph (DMJ) é a ataxia cerebelosa autossómica dominante mais comum a nível mundial. A repetição do trinucleotídeo CAG no gene MJD1 é traduzida numa cadeia de poliglutaminas na proteína ataxina-3. Há evidências que a proteólise desta proteína está envolvida no despoletar da DMJ. As calpaínas são cisteína-proteases dependentes de cálcio e medeiam a formação de fragmentos tóxicos, a translocação da ataxina-3 para o núcleo e neurodegenerescência. O objetivo deste projeto foi compreender in vivo a contribuição das calpaínas na patogénese da DMJ. Em particular, investigámos a) os locais de clivagem pelas calpaínas da proteína ataxina-3, b) qual o fragmento gerado pela clivagem mais tóxico e que mais drasticamente contribui para a localização nuclear da ataxina-3, agregação e neurotoxicidade, c) se a deleção dos locais de clivagem pelas calpaínas poderia prevenir alterações morfológicas e se poderia ser considerada como uma estratégia terapêutica para a DMJ, e d) a importância do sinal de localização nuclear (NLS) para a patologia. Para tal, gerámos construções resistentes às calpaínas e as formas truncadas nos locais previstos de clivagem da ataxina-3 por mutagénese por PCR invertido. Estas construções foram depois expressas por transdução de vetores lentivirais no cérebro de murganho adulto. Identificámos os presumíveis locais de clivagem pelas calpaínas tanto da ataxina-3 nativa como da mutante. A análise por Western-blot confirmou que a mutação destes locais conduziu à diminuição da formação dos fragmentos tóxicos. Adicionalmente, a análise imunohistoquímica usando o anticorpo anti-DARPP-32 sugeriu que é o fragmento de 26 kDa aquele que mais contribui para a degenerescência estriatal, independentemente da sequência NLS, confirmação esta reforçada por análise de secções submetidas a coloração de violeta de cresilo. No entanto, é necessária a diminuição simultânea da formação dos fragmentos de 26 e 34 kDa para que haja modificação da localização subcelular da ataxina-3 de agregados intranucleares para localização citoplasmática difusa nos neurónios. A mutagénese dos locais de clivagem pelas calpaínas promove um efeito neuroprotetor. Em resumo, estes resultados suportam a hipótese de que a clivagem da ataxina-3 pelas calpaínas é necessária ao subsequente processo de agregação e que a simples mutação dos locais de clivagem pelas calpaínas pode reduzir a agregação da ataxina-3 mutante por supressão da sua proteólise. Sendo assim, este trabalho sugere que o sistema de calpaínas deverá ser considerado como alvo de intervenção terapêutica na DMJ e em outras doenças neurodegenerativas vulneráveis à desregulação de cálcio. Acresce que a identificação dos locais de clivagem pelas calpaínas permitirá o desenvolvimento de fármacos mais específicos ou o uso de tecnologias de edição génica num local determinado.

Machado-Joseph disease (MJD) is the most frequent dominantly-inherited cerebellar ataxia worldwide. Over-repetition of a CAG trinucleotide in the MJD1 gene translates into a polyglutamine tract within the ataxin-3 protein, which upon proteolysis may trigger MJD. Calpains are calcium-dependent cysteine proteases, which mediate the formation of toxic fragments, ataxin-3 translocation to the nucleus and neurodegeneration.The aim of this project was to understand in vivo the calpains contribution to MJD pathogenesis. In particular, we investigated a) the calpain cleavage sites in ataxin-3 protein in vivo, b) which generated calpain cleavage fragment is more toxic and more drastically contributing to ataxin-3 nuclear localization, aggregation and neurotoxicity, c) whether calpain cleavage sites deletion can prevent morphologic alterations and be envisioned as a therapeutic strategy for MJD, and d) the importance of the nuclear localization signal (NLS) sequence to pathology. For this, we generated calpain-resistant constructs and truncated forms at the predicted cleavage sites of ataxin-3 by inverse PCR mutagenesis. These constructs were then expressed by lentiviral vectors transduction of the adult mouse brain. We identified the putative calpain cleavage sites for both wild-type and mutant ataxin-3. Western-blot analysis confirmed that the mutation of these sites led to the abrogation of the toxic fragments formation. Furthermore, immunohistochemical analysis using an anti-DARPP-32 antibody suggested that the 26 kDa fragment is the major contributor for striatal degeneration, independently of the NLS sequence, further confirmed by cresyl violet staining. Nevertheless, simultaneous decrease of the 26 and 34 kDa fragments formation is required for modification of subcellular localization of ataxin-3 from aggregated intranuclear into diffuse cytoplasmic localization within neurons. A neuroprotective effect is observed upon calpain cleavage sites mutagenesis. In conclusion, these results support the idea that ataxin-3 cleavage by calpains is required for the subsequent aggregation process and that the simple mutation of calpain cleavage sites can reduce mutant ataxin-3 aggregation by suppressing its proteolysis. Therefore, these findings suggest that the calpain system should be considered for MJD therapeutic intervention and also for other neurodegenerative diseases vulnerable to calcium deregulation. Furthermore, the identification of the calpain cleavage sites will allow the design of specific drugs or the use of tools for genome editing at a specific location.