Gender dimorphism of microglia morphology: adenosine and testosterone as putative modulators in transgender microglia experiments

Abstract

Eventos indutores de stress que ocorrem cedo no desenvolvimento têm sidoassociados à génese de doenças neuropsiquiátricas. Terapêuticas personalizadas sãoessenciais nestas doenças, atendendo a especificidades de género que algumas destasapresentam na sua génese, apresentação clínica e resposta à terapêutica. As células damicroglia, células imunes do sistema nervoso central, têm sido implicadas nafisiopatologia destas doenças, nomeadamente na ansiedade. Por exemplo, num estudoanterior do nosso grupo, observámos alterações morfológicas destas células, que sãodependentes do género, num modelo de ansiedade crónica com génese nodesenvolvimento (exposição pré-natal a glucocorticóides). Além disso, estas célulasapresentam um dimorfismo morfológico dependente do género na idade adulta, emcondições fisiológicas.Os recetores A2A da adenosina (A2AR) são moduladores bem descritos das célulasda microglia, que têm sido propostos como alvos terapêuticos em doençasneuropsiquiátricas. A modulação destes recetores promove alterações na morfologia damicroglia, que se associam à sua função. No modelo de ansiedade crónica com géneseno desenvolvimento, o bloqueio crónico dos A2AR reverte as alterações morfológicas e ocomportamento de tipo ansioso em machos, mas não em fêmeas. Esta modulação dosA2AR na idade adulta, por si só, promove um efeito dependente do género: uma atrofia namorfologia da microglia e um aumento do comportamento de tipo ansioso em fêmeas,sem afetar nenhum destes parâmetros em machos. Estas especificidades de género namodulação da morfologia da microglia e na apresentação do comportamento de tipoansioso neste modelo animal levaram-nos a colocar como hipótese uma influênciahormonal neste processo. Foi, assim, sugerido um papel protetor da testosterona nosmachos, atendendo à ocorrência de um pico ontogénico desta hormona no dia donascimento, que é responsável pela masculinização do cérebro e do comportamento.Os principais objetivos da presente tese são: ajudar a clarificar a modulaçãoespecífica de género que ocorre na morfologia da microglia pelos A2AR, clarificar a janelatemporal de surgimento das diferenças de género na morfologia da microglia no córtexpré-frontal (CPF), e avaliar o papel da testosterona na apresentação do comportamentode tipo ansioso e do rearranjo morfológico da microglia que lhe está associado no CPF.Na Secção 3.1., analisámos a morfologia da microglia no CPF de ratinhos quenão expressam o A2AR, a fim de verificar se a ausência da expressão do mesmo cedo nodesenvolvimento promove um rearranjo morfológico destas células de um mododependente do género. A ausência da expressão do A2AR promoveu uma hipertrofia da morfologia da microglia no CPF de fêmeas, mas não teve efeito nos machos. Destemodo, observámos o mesmo efeito do género previamente descrito aquando do boqueiofarmacológico do recetor na idade adulta. Contudo, nas fêmeas, o rearranjo morfológicoda microglia ocorreu em sentidos opostos, em função do estado de desenvolvimentoaquando da intervenção.Na Secção 3.2., analisámos a morfologia da microglia no CPF de ratos Wistar, emvárias fases da vida dos animais, procurando identificar o momento em que surgem asdiferenças de género nestas células, desde cedo no desenvolvimento (dia pós-natal,DPN0 e DPN7) até à juventude (DPN33). Não observámos diferenças de género namorfologia da microglia no CPF até ao DPN33. Contudo, quando analisámos odesempenho destes animais num teste que avalia comportamento de tipo ansioso,observámos uma maior “desinibição” das fêmeas naquela idade. Assim, concluímos queas diferenças de género na morfologia da microglia previamente descritas no CPFsurgirão entre os DPN33 e DPN90. Concluímos também que as diferenças de género nocomportamento surgem antes que as diferenças na morfologia da microglia sejamobserváveis.Na Secção 3.3., mimetizámos o pico neonatal de testosterona que ocorre nosmachos através da injeção desta hormona em fêmeas, e analisámos a morfologia damicroglia no CPF e o comportamento de tipo ansioso ao DPN30. Observámos que aandrogenização neonatal não modificou a morfologia da microglia no CPF das fêmeas aoDPN33; contudo, masculinizou parcialmente o seu comportamento: observámos umfenótipo intermédio entre o comportamento de tipo ansioso de machos e de fêmeas.Concluímos que o surgimento neonatal de testosterona que ocorre nos machos énecessário, mas não suficiente para masculinizar completamente o comportamento tipoansioso.Este trabalho evidencia o papel imperativo do género no desenvolvimentoneuroimune. Ter em consideração o género seria uma mais valia para a investigação emfarmacologia, tendo em conta que as diferenças no comportamento de tipo ansioso são jávisíveis na juventude e que podem ser parcialmente revertidas por hormonas masculinas.No futuro, terapêuticas direcionadas para o género poderão aumentar a eficácia dosfármacos, minimizando problemas de saúde pública.

Stressful events in the prenatal and in the early life periods have been associatedwith the genesis of neuropsychiatric disorders. Importantly, personalised therapeutics areessential in these disorders, since some of them possess gender specificities in thegenesis, clinical presentation and therapeutic efficacy. Microglia, the resident immunecells of the central nervous system, have been implicated in the pathophysiology of thesedisorders, namely anxiety. For instance, in a previous study from our group, we reported agender-specific morphological rearrangement of microglia cells in a model of chronicanxiety with developmental genesis (prenatal exposure to glucocorticoids). Moreover,these cells present a gender-specific morphology at adulthood, under physiologicalconditions.Adenosine A2A receptors (A2AR) are well described modulators of microglia,proposed as therapeutic targets in neuropsychiatric disorders. The modulation of A2ARpromotes morphologic alterations in these cells, which are widely associated with theirfunction. In our model of chronic anxiety with developmental genesis, the chronicblockade of these receptors normalized microglia morphology and ameliorated anxiouslikebehaviour in males, but not in females. Moreover, this modulation of A2AR atadulthood per se promoted a gender-biased effect: an atrophy in microglia morphologyand an increase in anxious-like behaviour in females, without affecting males. Thesegender specificities in the modulation of microglia morphology and in the presentation ofanxious-like behaviour in this animal model led us to hypothesize an hormonal influenceunderlying this process. A protective role was suggested for testosterone since, in males,an ontogenic surge of this hormone at the day of birth is responsible for themasculinisation of brain and behaviour.The present thesis pursues three main objectives: to further clarify the genderbiasedmodulation of microglia morphology by A2AR, to screen the time window ofappearance of gender differences in microglia morphology in the prefrontal cortex (PFC),and to disclose the role of testosterone in the presentation of anxious-like behaviour andassociated morphological reassignment of microglia in the PFC.In Section 3.1., we analysed microglia morphology in the PFC from A2AR knockoutmice, in order to assess whether the absence of expression of this receptor early indevelopment promotes a gender-specific morphological rearrangement of these cells. Thelack of expression of A2AR in these animals promoted an hypertrophy of microgliamorphology in the PFC of females, but had no effect in males. Thus, we can report thesame gender-effect previously described by blocking A2AR at adulthood. However, in females, the morphological rearrangement of microglia occurs in opposite fashions,according to the developmental stage of interference.In Section 3.2., we analysed microglia morphology in the PFC from Wistar rats,screening for the surge of gender differences in these cells, from the earlyneurodevelopment (PND0 and PND7) until youth (PND33). We did not observedifferences in microglia morphology in the PFC between genders until PND33. However,when we analysed the performance of these animals in the elevated plus maze test, a testthat measures anxious-like behaviour, we were able to report a higher “disinhibition” offemales at that age. In this section, we determined that the differences previouslydescribed in microglia morphology in the PFC may arise between PND33 and PND90.Moreover, we concluded that behavioural gender differences surge before the differencesin microglia morphology are observable.In Section 3.3., we mimicked the neonatal peak of testosterone that occurs inmales by injecting testosterone in females, and analysed microglia morphology in the PFCand anxious-like behaviour at PND30. We observed that the neonatal androgenisation didnot alter microglia morphology in the PFC of females at PND33, however this was able topartially masculinise their behaviour: we reported an intermediate phenotype betweenmales and females in anxious-like behaviour. These results led us to conclude that theneonatal peak of testosterone in males is necessary, but not sufficient to fully masculiniseanxious-like behaviour.This work highlights the imperative role of gender in the neuroimmunedevelopment. It would be valuable to consider gender in pharmacological research, sincedifferences in anxious-like behaviour are already observable at youth and can be partiallyreversed by male hormones. In the future, gender-directed therapeutics may increase theeffectiveness of drugs, reducing these public health problems and improving lifestyle.