Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/7449
Title: Real-time change of nitric oxide in rat hippocampal slices and astrocytic glutathione release via glutamate-dependent pathways
Authors: Frade, João Gonçalo Leal de Oliveira e Silva 
Orientador: Laranjinha, João
Keywords: Óxido nítrico; Receptores ionotrópicos; Glutamato
Issue Date: 15-Sep-2008
Citation: Frade, João Gonçalo Leal de Oliveira e Silva - Real-time change of nitric oxide in rat hippocampal slices and astrocytic glutathione release via glutamate-dependent pathways. Coimbra, 2007.
Abstract: Nitric oxide (•NO) is a multi-faceted radicalar messenger involved in the modulation of numerous biological processes. It is implicated in the regulation of physiological events such as neuronal plasticity, host defense and blood flow, but may also trigger cell toxic pathways, notably cell death associated with neurodegenerative processes. The bioactivity of •NO is afforded by its unusual chemical properties. •NO is a highly diffusible molecule that permeates membranes after being produced, thus conveying information by its local concentration, rather than by its chemical structural features, as happens with other classical modulators. A critical insight towards its role in vivo depends on the assessment of its concentration dynamics, both in time and space. The same properties that determine its unique biological effects also make its measurement a challenging task, particularly because of its gaseous nature and reactivity, which limit its half-life. Given this scenario, it has been a challenging task determining the rate and pattern of •NO changes in hippocampus following stimulation of ionotropic glutamate receptors, because of the involvement of glutamate receptor-dependent •NO production in both the mechanisms of synaptic plasticity and those of neurodegeneration via excitotoxic phenomena. In this work, the use of microsensors endowed with appropriate analytical properties allowed the real-time measurement of endogenous •NO production in rat hippocampal slices with minimal tissue damage, via activation of glutamate ionotropic receptors. Stimulation of slices with glutamate, NMDA and AMPA clearly uncovered the transitory nature of •NO signals, pointing to operating regulatory mechanisms not only for the production but also for the decay. When using the physiological agonist glutamate, a much higher concentration was required (up to 100 fold) to induce the production of •NO, as compared with NMDA, in what was considered to be the result of active glutamate regulatory mechanisms in synapses. In this regard, the use of NMDA overcame these mechanisms and the concentration-dependent relationship between the agonist and •NO signals highlighted a close physiological interaction between NMDAR and nNOS. Still, when using NMDA, signals were shown to decrease upon consecutive stimulations, regardless of agonist concentration and signal amplitude, suggesting the activation of pathways that critically shape •NO signals. This was further supported by continuously stimulating slices with NMDA (as a model for excitotoxic conditions where glutamate receptors and NOS are overactivated), where a higher and transitory •NO production was observed. These distinct features were also apparent when using KCl and the NOS substrate L-arginine as stimuli. When addressing the role of AMPAR receptors in •NO production it was found that, as compared with NMDAR, AMPA stimulation resulted in a marked and distinct •NO transitory production, which was dependent on extracellular Ca2+ and independent of NMDAR activation. A slower rate of production and lower •NO levels, despite similar recovery periods to baseline, point to a less effective coupling with nNOS, and agree with the notion of a fine tuning of •NO production via AMPAR activation. Excitotoxic conditions like the one mimicked by stimulating slices continuously with NMDA presumably lead to the activation of protective mechanisms. Amongst these is glutathione (GSH), a major endogenous antioxidant released by astrocytes to support and protect neurons in harmful conditions. When investigating the response of astrocytes in the presence of high glutamate it was observed an increase in extracellular GSH. Results suggest intracellular GSH release to be the mechanism responsible for the observed increase, and this is proposed to be a possible protective mechanism against glutamate toxicity.
O óxido nítrico (•NO) é um mensageiro celular multifacetado e tem sido objecto de intensa investigação científica em sistemas biológicos. Está implicado na regulação de eventos fisiológicos, onde se destacam a plasticidade neuronal, a resposta imunitária e a circulação sanguínea, mas também em vias de toxicidade celular, em particular a morte celular associada a processos neurodegenerativos. A bioactividade do •NO resulta das suas invulgares propriedades químicas. O •NO é uma molécula radicalar altamente difusível composta por apenas dois átomos que, uma vez produzido, permeia membranas, actuando como mensageiro intercelular. A informação associada ao •NO, estará, pois, contida no gradiente da sua concentração, independentemente de características estruturais que suportam interacções selectivas e complementares com alvos moleculares, como acontece com outros moduladores celulares. Dado este cenário, a determinação da dinâmica de concentração de •NO em tecidos, tanto no tempo como no espaço, é determinante para a clarificação da sua função in vivo. Contudo, as mesmas características químicas que conferem ao •NO efeitos biológicos singulares tornam também particularmente difícil a sua detecção em tempo real, em especial devido à sua natureza gasosa e ao seu reduzido tempo de meiavida. A medição da velocidade de formação e o perfil de variação do •NO no hipocampo, em resultado da activação de receptores ionotrópicos do glutamato, assumem particular relevância, uma vez que estes se encontram envolvidos em mecanismos de plasticidade sináptica e em neurodegenerescência desencadeada por eventos excitotóxicos. Neste trabalho, o fabrico de microsensores com propriedades analíticas adequadas para a detecção de •NO permitiu a medição em tempo real deste mensageiro, quando produzido endogenamente em fatias de hipocampo de rato, na sequência de activação de receptores ionotrópicos de glutamato. Quando comparada com outras estratégias experimentais, a utilização desta ferramenta de análise permitiu estudar a dinâmica de produção e decaimento do •NO produzido endogenamente, suprindo assim um aspecto frequentemente negligenciado na área. Neste âmbito, a utilização de glutamato, NMDA e AMPA revelou claramente a natureza transitória dos sinais de •NO, apontando para a ocorrência de mecanismos regulatórios importantes não apenas na sua produção mas também no seu decaimento. A estimulação de fatias com o agonista fisiológico glutamato implicou um aumento significativo da sua concentração (até 100 vezes) para induzir a produção de •NO, quando comparada com estimulações usando NMDA ou AMPA, observação explicada pela existência de mecanismos regulatórios da concentração de glutamato em sinapses. Nesta perspectiva, a utilização do agonista não fisiológico NMDA permitiu ultrapassar estes mecanismos e destacar a interacção física e funcional entre receptores NMDA e nNOS, patente na clara dependência dos sinais de •NO obtidos face à concentração de agonista utilizada. Contudo, e apesar desta relação, os sinais de •NO obtidos após estimulações consecutivas com NMDA decaíram em intensidade de forma independente da concentração do agonista ou da intensidade de •NO inicialmente obtida. Este último aspecto é de destacar, pois implica que a perda de intensidade observada não depende da concentração de •NO per se (e consequentemente de um efeito tóxico tantas vezes atribuído ao •NO), mas antes sugere a activação de mecanismos de regulação que determinam a sua produção endógena. Esta observação foi confirmada por estimulação contínua de fatias com NMDA (considerada um modelo de excitotoxicidade, em virtude da sobreactivação de receptores de glutamato e nNOS), onde uma maior mas ainda assim transitória produção de •NO foi observada e, particularmente, em condições onde os receptores NMDA demonstraram estar activados (pelo menos parcialmente). Nesta linha, padrões distintos foram também obtidos aquando da utilização de KCl e o substrato de nNOS L-arginina. A investigação respeitante ao papel dos receptores AMPA na produção de •NO, quando comparada com a actividade dos receptores NMDA, revelou que a estimulação com AMPA induziu uma pronunciada mas distinta produção transitória de •NO. Esta revelou ser dependente de Ca2+ extracelular e independente da activação de receptores NMDA, tendo sido registados sinais onde a concentração de pico do •NO foi observada mais tardiamente. A observação de uma menor velocidade de produção e concentrações mais baixos de •NO, apesar de ocorrer para periodos de recuperação semelhantes quando comparados com os obtidos com NMDA, sugerem um acoplamento menos eficiente entre receptores AMPA com a nNOS, o que está de acordo com a noção de um controlo fino da produção de •NO via activação de receptores AMPA. A participação de receptores AMPA na produção endógena de •NO foi ainda verificada por inibição selectiva dos receptores ionotrópicos de glutamato na presença de glutamato, demonstrando o mesmo efeito mediado pelo agonista fisiológico. Na tentativa de determinar a origem de Ca2+ essencial à actividade da nNOS ficou patente uma contribuição, ainda que parcial, de receptores AMPA permeáveis a Ca2+, o que constituiu uma observação surpreendente face à baixa expressão destes receptores no hipocampo descrita na literatura. Condições de excitotoxicidade onde se reproduz uma activação continuada de receptores NMDA levam, presumivelmente, à activação de mecanismos celulares protectores. Entre estes encontra-se o glutatião (GSH), um antioxidante endógeno libertado por astrócitos para protecção e suporte de neurónios em condições fisiológicas e de elevada toxicidade celular. Ao investigar-se a resposta dos astrócitos na presença de uma elevada concentração de glutamato observou-se o aumento de GSH extracelular ao longo do tempo. As experiências realizadas excluiram, como mecanismos responsável por este aumento, a ruptura da membrana plasmática e consequente libertação de conteúdos membranares, síntese de novo de GSH, inibição dos mecanismos extracelulares de degradação de GSH por glutamato e activação de receptores membranares de glutamato. Os resultados sugerem, portanto, que a libertação de GSH intracelular é o mecanismo responsável pelo aumento observado, sendo proposto como um mecanismo de protecção contra a toxicidade do glutamato.
Description: Tese de doutoramento em Bioquímica (Toxicologia Bioquímica) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia da Univ. de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/7449
Rights: openAccess
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