Development and characterization of cellulose based systems for the entrapment and delivery of probiotic bacteria

Abstract

Probiotics are increasing their popularity in the market, as their health benefits are being progressively recognized by the public. They are already included in some foods and representing global sales above $30 billion. There is, however, a key issue that concerns the scientists: in order to promote their beneficial effects in the host, probiotics must survive the harsh conditions of the gastrointestinal (GI) tract and should be able of reaching the large intestine to enable colonization. A possible approach to overcome this issue is to entrap the bacteria in suitable matrices, which ideally maintain the bacteria viable and culturable along with other preservation compounds through the GI tract and capable to provide its controlled release. This project mainly aimed at developing biopolymer-based systems to be used in food applications. Food and drug administration (FDA) approved cellulose based derivatives were selected and mixed with different polymers/compounds as additives/emulsifiers/prebiotics to enhance the viability of bacteria, create more stable delivery systems and sustain the different storage conditions as well as maintaining the viability for a minimum of 30 days. Therefore, in this work, novel micro- and macroparticles, based on carboxymethyl cellulose (CMC) and chitosan (Cht) (cross-linked or not with genipin), were successfully prepared in aqueous media either by drop-wise addition or via nozzle-spray methods. The crosslinked particles are robust, thermally resistant and less sensitive to pH changes. On the other hand, the physical systems are pH sensitive presenting a remarkable swelling at pH 7.4, while little swelling is observed at pH 2.4. Model probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus GG) were successfully encapsulated in the CMC-Cht based particles with acceptable viability count. In a subsequent step, different cyclodextrins (CDs) were used in the particle formulation and their potential prebiotic effect evaluated. The morphology of the systems depends on the CD used and this may be related to different “host-guest” interactions between the CDs and the CMC-Cht matrix thus affecting the polymer organization and overall particle microstructure. Among the CDs tested, β-CD was observed to be one of the most efficient molecules to enhance the survival of the cells. In order to improve the developed particles in terms of aggregation and colloidal stability, different food grade compounds were included in the formulations, such as caseinate and soy lecithin. Apart from the micro- and macro particles other methods were used to entrap probiotics such as the formation of water-in-water (W/W) emulsions based on gelatin and CMC. Depending on the conditions, the mixtures can lead to the formation of W/W emulsion droplets and model probiotic bacteria could be successfully entrapped with surprisingly high viability count. Finally, cellulose-based edible films with CMC and HEC (hydroxyethyl cellulose) cross-linked with citric acid (CA) were also developed under mild conditions. Films with tunable mechanical properties and swelling ability could be obtained by varying the HEC/CMC ratio and the amount of CA. It is salient to notice that some of the systems tested can be considered prebiotics since the viability count of model probiotic bacteria, entrapped in CMC-Cht particles, was considerably improved after the incorporation of CDs and gelatin in the formulation. Further studies on the aging and behavior of the particles in simulated gastrointestinal fluids were performed. Particles loaded with caseinate, soy lecithin or cyclodextrins showed an improved viability of LGG even after one month storage at 25 ºC. In most of the cases, matrices were also capable to efficiently protect the cells from the simulated harsh gastric conditions with a remarkable viability in comparison to naked probiotic. The cellulose-based particles developed were also evaluated regarding their effect on an intestinal cell line and the results indicate that the systems are reasonably mild for the cells and thus encouraging for future applications. Overall, all the systems developed in this work could efficiently entrap and preserve viable bacteria thus being promising matrices for food applications.

Os probióticos têm visto a sua popularidade no mercado aumentar em grande medida devido ao reconhecimento do público dos seus efeitos benéficos para a saúde. Eles já são incluídos em muitos produtos alimentares que representam um total global de vendas de cerca de 30 mil milhões de dólares. No entanto, existe uma questão central que continua a preocupar os cientistas. Para que os probioticos exerçam os seus efeitos benéficos no hospedeiro eles têm que sobreviver às condições particularmente adversas do sistema gastrointestinal e atingir o intestino grosso com viabilidade aceitável para uma colonização eficiente. Uma possível estratégia para ultrapassar os obstáculos impostos pelo trato gastrointestinal reside na proteção dos probióticos em matrizes apropriadas par ao efeito. Idealmente estes sistemas em combinação com outros compostos serão capazes de manter as bactérias viáveis e cultiváveis ao longo do trato gastrointestinal e promover a sua libertação no sítio apropriado. Este projeto tem como objetivo principal o desenvolvimento de sistemas baseados em biopolímeros para aplicações na área alimentar. Foram selecionados derivados de celulose aprovados pela agência para os alimentos e medicamentos (FDA) e misturados com outros polímeros e compostos como agentes emulsificantes, prebióticos, ciclodextrinas para aumentar a viabilidade das bactérias probióticas e criar vetores de entrega mais estáveis e capazes de resistir a diferentes condições de armazenamento e manter uma viabilidade aceitável durante pelo menos 30 dias. Tendo isto em consideração, neste trabalho foram desenvolvidas novas micro e macro partículas à base de carboximetilcelulose (CMC) e quitosano (Cht) (reticuladas ou não com genipina) em meio aquoso através de um procedimento de adição gota-a-gota ou spray. As partículas reticuladas são robustas e termicamente resistentes e pouco sensíveis a variações de pH. Por outro lado, os sistemas físicos são mais sensíveis às variações de pH apresentando uma turgescência assinalável a pH 7.4 enquanto a turgescência a pH 2.4 é menosprezável. Neste trabalho foram encapsuladas bactérias probioticas modelo (Lactobacillus rhamnosus GG) em partículas de CMC-Cht com viabilidade aceitável. Numa etapa subsequente, diferentes ciclodextrinas (CDs) foram usadas na formação das partículas e avaliado o seu eventual efeito prebiótico. A morfologia dos sistemas é fortemente dependente do tipo de CD usado e tal fato pode estar relacionado com as diferentes interações “hospedeiro-hospede” entre CDs e a componentes da matriz de CMC-Cht que eventualmente afetam a organização dos polímeros e microestrutura das partículas. De entre as CDs testadas, a β-CD foi aquela que se mostrou mais eficiente no aumento da viabilidade dos probióticos. De forma a melhorar a estabilidade das partículas em termos de minimizar a agregação, foram usados na formulação diferentes compostos de qualidade alimentar como caseinato de sódio e lecitina. Para além da formação das micro e macro partículas foram desenvolvidos outros sistemas para “aprisionar” os agentes probióticos como emulsões de água-em-água (W/W) à base de CMC e gelatina. Dependendo das condições, estas misturas podem levar à formulação de emulsões onde é possível aprisionar de forma satisfatória e com surpreendente elevada viabilidade as bactérias probióticas modelo. Finalmente foram ainda desenvolvidos filmes comestíveis à base dos derivados de celulose CMC e hidroxietilcelulose (HEC) reticulados com ácido cítrico. As propriedades mecânicas e de turgescência podem ser ajustadas dependendo do rácio HEC/CMC e concentração de ácido cítrico. È importante notar que alguns dos sistemas desenvolvidos comportam-se como prebióticos pois a viabilidade das bactérias probióticas modelo aumentou consideravelmente depois da incorporação de CDs ou gelatina na formulação. Foram realizados ainda alguns estudos de envelhecimento e comportamento das partículas em fluidos gastrointestinais artificiais. As partículas com caseinato de sódio, lecitina e CDs demonstraram um melhoramento na viabilidade depois de armazenadas um mês a 25 ºC. Na maior parte dos casos, as matrizes polimericas desenvolvidas foram capazes de proteger de forma muito satisfatória as células próbioticas das condições adversas impostas pelos sucos gástricos artificiais resultando em viabilidades assinaláveis em comparação com as bactérias não protegidas. As partículas desenvolvidas à base de celulose foram ainda avaliadas tendo em conta o seu impacto numa linha celular intestinal e os resultados indicam que os sistemas são relativamente inócuos para as células intestinais. De forma geral, os sistemas desenvolvidos no decorrer deste trabalho conseguem de forma eficiente encapsular e preservar a viabilidade dos agente probióticos e portanto podem ser consideradas matrizes promissoras para futuras aplicações alimentares.

Keywords: Cellulose derivatives, Probiotics, Prebiotics, LGG, delivery, viability. Palavras-chave: Derivados de celulose, probióticos, prebióticos, LGG, entrega, viabilidade.

Os probióticos têm visto a sua popularidade no mercado aumentar em grande medida devido ao reconhecimento do público dos seus efeitos benéficos para a saúde. Eles já são incluídos em muitos produtos alimentares que representam um total global de vendas de cerca de 30 mil milhões de dólares. No entanto, existe uma questão central que continua a preocupar os cientistas. Para que os probioticos exerçam os seus efeitos benéficos no hospedeiro eles têm que sobreviver às condições particularmente adversas do sistema gastrointestinal e atingir o intestino grosso com viabilidade aceitável para uma colonização eficiente. Uma possível estratégia para ultrapassar os obstáculos impostos pelo trato gastrointestinal reside na proteção dos probióticos em matrizes apropriadas par ao efeito. Idealmente estes sistemas em combinação com outros compostos serão capazes de manter as bactérias viáveis e cultiváveis ao longo do trato gastrointestinal e promover a sua libertação no sítio apropriado. Este projeto tem como objetivo principal o desenvolvimento de sistemas baseados em biopolímeros para aplicações na área alimentar. Foram selecionados derivados de celulose aprovados pela agência para os alimentos e medicamentos (FDA) e misturados com outros polímeros e compostos como agentes emulsificantes, prebióticos, ciclodextrinas para aumentar a viabilidade das bactérias probióticas e criar vetores de entrega mais estáveis e capazes de resistir a diferentes condições de armazenamento e manter uma viabilidade aceitável durante pelo menos 30 dias. Tendo isto em consideração, neste trabalho foram desenvolvidas novas micro e macro partículas à base de carboximetilcelulose (CMC) e quitosano (Cht) (reticuladas ou não com genipina) em meio aquoso através de um procedimento de adição gota-a-gota ou spray. As partículas reticuladas são robustas e termicamente resistentes e pouco sensíveis a variações de pH. Por outro lado, os sistemas físicos são mais sensíveis às variações de pH apresentando uma turgescência assinalável a pH 7.4 enquanto a turgescência a pH 2.4 é menosprezável. Neste trabalho foram encapsuladas bactérias probioticas modelo (Lactobacillus rhamnosus GG) em partículas de CMC-Cht com viabilidade aceitável. Numa etapa subsequente, diferentes ciclodextrinas (CDs) foram usadas na formação das partículas e avaliado o seu eventual efeito prebiótico. A morfologia dos sistemas é fortemente dependente do tipo de CD usado e tal fato pode estar relacionado com as diferentes interações “hospedeiro-hospede” entre CDs e a componentes da matriz de CMC-Cht que eventualmente afetam a organização dos polímeros e microestrutura das partículas. De entre as CDs testadas, a β-CD foi aquela que se mostrou mais eficiente no aumento da viabilidade dos probióticos. De forma a melhorar a estabilidade das partículas em termos de minimizar a agregação, foram usados na formulação diferentes compostos de qualidade alimentar como caseinato de sódio e lecitina. Para além da formação das micro e macro partículas foram desenvolvidos outros sistemas para “aprisionar” os agentes probióticos como emulsões de água-em-água (W/W) à base de CMC e gelatina. Dependendo das condições, estas misturas podem levar à formulação de emulsões onde é possível aprisionar de forma satisfatória e com surpreendente elevada viabilidade as bactérias probióticas modelo. Finalmente foram ainda desenvolvidos filmes comestíveis à base dos derivados de celulose CMC e hidroxietilcelulose (HEC) reticulados com ácido cítrico. As propriedades mecânicas e de turgescência podem ser ajustadas dependendo do rácio HEC/CMC e concentração de ácido cítrico. É importante notar que alguns dos sistemas desenvolvidos comportam-se como prebióticos pois a viabilidade das bactérias probióticas modelo aumentou consideravelmente depois da incorporação de CDs ou gelatina na formulação. Foram realizados ainda alguns estudos de envelhecimento e comportamento das partículas em fluidos gastrointestinais artificiais. As partículas com caseinato de sódio, lecitina e CDs demonstraram um melhoramento na viabilidade depois de armazenadas um mês a 25 ºC. Na maior parte dos casos, as matrizes polimericas desenvolvidas foram capazes de proteger de forma muito satisfatória as células próbioticas das condições adversas impostas pelos sucos gástricos artificiais resultando em viabilidades assinaláveis em comparação com as bactérias não protegidas. As partículas desenvolvidas à base de celulose foram ainda avaliadas tendo em conta o seu impacto numa linha celular intestinal e os resultados indicam que os sistemas são relativamente inócuos para as células intestinais. De forma geral, os sistemas desenvolvidos no decorrer deste trabalho conseguem de forma eficiente encapsular e preservar a viabilidade dos agente probióticos e portanto podem ser consideradas matrizes promissoras para futuras aplicações alimentares.