Avaliação molecular de músculos mastigadores após administração experimental de um carcinogénio

Abstract

As neoplasias da cavidade oral continuam a reclamar grandes prejuízos para a saúde e bem-estar de muitos doentes em todo o mundo. Muito embora se saiba cada vez mais dos processos oncogénicos e das suas características morfo-histológicas, existem ainda dificuldades a superar. O advento da análise molecular, nas suas diferentes variantes, permite a obtenção de novos paradigmas que até há alguns anos eram considerados quase utópicos. A metabolómica, especialmente na sua variante de espectrometria NMR por HRMAS, se aplicada em tecidos neoplásicos e comparada com tecidos saudáveis, permite a obtenção de dados que se pensam ser cada vez mais críticos para a escolha do tratamento a efectuar, influências sobre factores prognósticos e, mais fundamental, na obtenção de diagnósticos precoces da doença. No presente estudo foram usados 16 ratos da estirpe Wistar com 2 meses de idade. Estes foram divididos aleatoriamente por 2 grupos, um grupo controlo e um grupo teste. O grupo controlo não sofreu qualquer tipo de manipulação. O grupo teste foi submetido à administração de 25 mg/kg de 7,12-dimetilbenz(a)antraceno por sonda intra-gástrica, três vezes ao dia. Todos os animais foram mantidos em condições padrão do biotério, com água e ração standard ad libitum até duas semanas, findas as quais foram sacrificados. Todos os fragmentos foram fixados em formol tamponado a 10% e os fragmentos dos músculos masseter e temporal foram fixados em etanol a 70%. Foram ainda colhidos fragmentos dos músculos masseter e temporal de todos os animais para congelação rápida e conservação em azoto líquido a -70ºC. Todos os fragmentos foram incluídos em parafina líquida e cortados num micrótomo, para posterior coloração histológica por HE de rotina. Foram posteriormente efectuadas análises morfométricas e metabolómica. Na análise morfométrica foram analisadas fibras musculares em corte transversal e medida a sua área de secção. Foram definidas cinco classes de fibras musculares – muito pequenas, pequenas, médias, grandes e muito grandes – sendo posteriormente catalogadas. Para a análise metabolómica, os fragmentos do músculo temporal do grupo controlo foram colhidos e analisados num espectrómetro HRMAS de alta resolução com sonda 1H, sendo o espectro obtido posteriormente analisado. Os resultados da análise morfométrica revelaram um ligeiro aumento das fibras musculares provenientes do músculo masseter, com pouca significância. Já as fibras musculares provenientes do músculo temporal revelaram um grande aumento na área de secção, de relevância significativa. Na análise metabolómica determinámos os metabolitos-chave presentes nos músculos masseter do grupo controlo, para estudos posteriores. Em conclusão, podemos afirmar que o agente 7,12-dimetilbenz(a)antraceno provoca alterações nos músculos mastigadores, especialmente nos músculos temporais, sendo necessários estudos mais aprofundados. Oral neoplasias continue to claim a great toll on the health and well-being of patients worldwide. Even though studies about oncogenic processes and morpho-histological characteristics add up valuable information, there are still some obstacles to overcome. Molecular analysis with their multiple methods and protocols allows the achievement of newer informations that once were considered utopia. Metabolomics in its 1H HRMAS form can be applied successfully when analyzing diseased tissue and comparing it to healthy tissue, obtaining valuable information with regards to treatment methods, prognosis factors, and more importantly, early diagnosis. On the current study, 16 male Wistar rats, with 2 months of age, were divided in two groups randomly (control and test group). All animals were kept in standard bioterium conditions, with ad libitum water and standardized ration. Animals in the test group were doused with 25mg/kg 7,12-dimethylbenz(a)anthracene by gavage, during two weeks on the end of which they were sacrificed. All fragments were fixed in 10% buffered formaldehyde and fragments of masseter and temporal muscles were collected and fixed in 70% ethanol. In all animals, two fragments of masseter and temporal muscles were collected for quick-freezing and conservation in -70ºC liquid nitrogen. All fragments collected for routine histopathology were included in liquid paraffin and cut in a microtome, being then colorized in HE standard protocol. Morphometric and metabolomic analysis to the masticator muscles was then performed. In the morphometric analysis, muscular fibers were analyzed in transversal cuts, measuring their section area. Five muscle fiber groups – very small, small, medium, large and very large - were then defined and both groups were then categorized. In the metabolomic analysis, fragments collected from masseter muscle control group were submitted to high-resolution 1H probe HRMAS, analyzing each of the metabolites obtained through the control spectra. The results obtained from morphometric analysis revealed a slight increase in muscle fiber area from masseter muscles, with little significance. Temporal muscle, on the other hand, revealed a significant increase in muscle fiber area. In the metabolomic analysis we determined the key metabolites derived from control masseter muscles for future studies. In conclusion, we are able to say that 7,12-dimethylbenz(a)anthracene can induce alterations in masticator muscles, especially in the temporal muscle, being however necessary further studies.