MIRNA-BASED METABOLIC MODULATION IN GLIOBLASTOMA CELLS: A STRATEGY TO SURPASS TUMOR CHEMORESISTANCE

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most aggressive and common form of primary brain tumour characterized by fast proliferation, high invasion, and resistance to current standard treatment. The average survival rate post-diagnosis is only of 14.6 months, despite the aggressive standard post-surgery treatment approaches of radiotherapy concomitant with chemotherapy with temozolomide (TMZ). Currently, efforts are being endowed to develop a new and more efficient therapeutic approach capable to overcome chemoresistance, and to inhibit tumour progression and improve overall patient survival rate. Abnormal microRNA (miRNA) expression levels have been correlated with chemoresistance, proliferation and resistance to apoptosis, which result from their master regulatory role of molecular pathways important for these tumoral features. Additionally, altered cell metabolism, favouring glycolysis, has been identified as an emerging cancer hallmark and has been intensively described in GBM, thus offering a new target for new GBM therapies. In this work, we hypothesized that gene therapy based on modulation of miRNAs with aberrant expression in GBM and predicted to target crucial metabolic enzymes might promote a shift of GBM cell metabolism, decreasing the glycolytic dependence of tumor cells and contributing to their sensitization to chemotherapeutic agents. We have found that the transient increase of hsa-miR-200-3p and hsa-miR-144-3p levels, shown to be underexpressed in U87 and DBTRG human GBM cell lines, promoted the downregulation of mRNA of enzymes involved in bioenergetic pathways, with consequent alterations in cell metabolism. In this context, both miRNAs showed to be effective in inhibiting glycolysis in U87 cells, whereas in DBTRG cells hsa-miR-144 inhibited mitochondrial respiration and hsa-miR-200c-3p inhibited both mitochondrial respiration and glycolysis. Furthermore, modulation of both miRNAs impaired the migratory capacity of DBTRG cells, which, per se, indicates the potential therapeutic value of these miRNAs. Additionally, the ability of miRNA modulation to sensitize U87 and DBTRG cells to the chemotherapeutic drugs dichloroacetate (DCA) and TMZ was evaluated. Although no differences in U87 cell viability were found between cells treated with either drug and those submitted to the drug treatment combined with miRNA mimics, DBTRG cells became more sensitive to DCA and TMZ after hsa-miR-200c-3p modulation. Overall, our results show that the bioenergetic pathways constitute a promising therapeutic target of miRNA modulation to overcome chemoresistance mechanisms in GBM cells.

O glioblastoma (GBM) é o tipo mais agressivo e comum de tumor cerebral primário, caracterizado por uma rápida proliferação, elevada capacidade invasiva e resistência à terapia convencional. A taxa média de sobrevivência após diagnóstico é de apenas 14.6 meses, após uma terapia agressiva pós-cirúrgica, consistindo em radioterapia e quimioterapia com temozolamide (TMZ). Atualmente, têm sido desenvolvidos esforços no sentido de encontrar novas terapias, mais eficientes e capazes de obviar a quimioresistência, inibir a progressão do tumor e aumentar a taxa de sobrevivência dos doentes. Em virtude do papel dos microRNAs (miRNAs) como reguladores de mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de GBM, a expressão anómala destas moléculas tem-se revelado responsável pelas características de extrema agressividade deste tumor. Alterações metabólicas que favorecem a dependência energética da glicólise, amplamente descritas em GBM, foram recentemente identificadas como características típicas das células cancerígenas, constituindo desse modo novos alvos terapêuticos para GBM. Neste trabalho, concebeu-se uma estratégia de terapia génica para GBM, baseada na regulação de miRNAs, cujos níveis se encontram alterados neste tumor e cujos alvos previstos incluem enzimas metabólicas. Esta abordagem resultaria numa alteração do metabolismo das células de GBM, diminuindo a sua dependência da via glicolítica e contribuindo para a sua sensibilização a agentes quimioterapêuticos. Demonstrou-se que o aumento transiente dos níveis de expressão dos miRNAs hsa-miR-200c-3p e hsa-miR-1443p, em linhas celulares humanas de GBM (U87 e DBTRG), promoveu uma diminuição da expressão dos seus alvos envolvidos nas vias do metabolismo bioenergético, com consequentes alterações no metabolismo celular. Neste contexto, ambos os miRNAs inibiram a via glicolítica em células U87, ao passo que em células DBTRG o hsa-miR-144-3p demonstrou ser efetivo na inibição da glicólise e o hsa-miR-200c-3p inibiu a respiração mitocondrial e a glicólise. Adicionalmente, o aumento dos níveis de ambos os miRNAs resultou na diminuição da capacidade migratória das células DBTRG, o que aponta para um potencial terapêutico destes miRNAs. Além disso, avaliou-se o efeito da terapia combinada, consistindo no aumento dos níveis de miRNAs, seguido de incubação com os fármacos dicloroacetato (DCA) e TMZ, na viabilidade de células U87 e DBTRG. Apesar de não terem sido encontradas diferenças entre células U87 incubadas com cada um dos fármacos e com o tratamento combinado, em células DBTRG o aumento dos níveis do hsa—miR-200c-3p resultou num maior efeito tanto do DCA como do TMZ. O conjunto dos nossos resultados demonstra que as vias do metabolismo bioenergético são alvos promissores da ação de miRNAs, que, em combinação com quimioterapia, poderá constituir uma abordagem promissora no tratamento de GBM.