Oxidoreductase protein family interaction with DJ-1 and oxidative stress-induced modulation of HADHA interactome

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, sendo a mais incidente dentro das doenças do movimento, e caracterizada por uma drástica perca de neurónios dopaminérgicos na região cerebral substantia nigra pars compacta (SNpc), levando à degeneração dos circuitos dopaminérgicos nigroestriatais. Várias evidências apontam para diversas disfunções celulares importantes na patogénese da DP, incluindo o stress oxidativo. Apesar de vários estudos na área terem sido realizados para uma maior elucidação sobre a doença, a etiologia e patogénese da Doença de Parkinson continuam por estar esclarecidas. No entanto, é sabido que a causa da maioria dos casos de DP são esporádicos, e que alguns casos raros têm uma componente genética, hereditária. De facto, diversas mutações em diversos genes têm sido identificadas como causadoras da forma hereditária da doença, o que contribuiu com importantes conhecimentos sobre os mecanismos moleculares que levam à neurodegeneração. O gene dj1, associado às formas genéticas da DP, foi identificado como sendo um gene autossómico recessivo responsável pela DP familiar, que se desenvolve em idades mais novas, o que o torna um candidato para ser estudado de forma a fornecer importantes conhecimentos sobre os mecanismos moleculares da doença. Várias funções foram atribuídas à proteína DJ-1, no entanto o seu papel de neuroprotecção é o mais relevante, provavelmente devido ao seu envolvimento na proteção contra o stress oxidativo. Estudos indicam que a proteína DJ-1 opera em diversos níveis interagindo, direta ou indiretamente, com várias proteínas. Apesar dos mecanismos através dos quais a proteína exerce a sua função neuroprotetora não serem completamente conhecidos, esta aparenta ter uma importante função na mediação de vias de sinalização e na modelação do metabolismo oxidativo. Vários estudos demonstraram que de facto o stress oxidativo é a condição que despoleta a função neuroprotectiva da DJ-1, alterando a conformação da proteína para uma forma oxidada, que é considerada a sua forma ativa. Além do mais, a estabilidade da maioria das interações estudadas entre a DJ-1 e outras proteínas é influenciada pelo seu estado oxidativo. Tendo isto em mente, o interatoma dinâmico da DJ-1 foi anteriormente estudado, de forma a fornecer uma caracterização abrangente dos interatores da proteína em condições do stress oxidativo. Este estudo possibilitou a identificação de diversas proteínas que interagem com a DJ-1, nomeadamente proteínas pertencentes à família das oxidoredutases, que estão relacionadas com a resposta celular ao stress oxidativo, como a NDUFA4, PGDH e a HADHA. No entanto, as interações da DJ-1 com essas proteínas estão ainda por serem validadas. Dentro deste contexto, diversas análises complementares foram realizadas de forma a validar a interação da DJ-1 com as proteínas pertencentes à família das oxidoredutases, incluindo imunoprecipitação, pull down e imunocitoquímica seguida de uma análise por microscopia confocal, em condições fisiológicas e de stress oxidativo. através do ensaio de imunocitoquímica seguido de análise por confocal das células SH-SY5Y, foi possível validar a interação entre as proteínas in situ, o que parece confirmar que tanto a HADHA como a PGDH são interatores da DJ- 1. Além disso, os resultados obtides através da análise por pull down sugerem uma interação das proteínas HADHA e PGDH com a proteína DJ-1 recombinante, na sua forma nativa, sendo essa interação aparentemente modelado pelo stress oxidativo, o que vem corroborar a os esukltados anteriores.foi utilizado de forma a estudar o interatoma da proteína em células SH-SY5Y em células expostas ao stress oxidativo ou em condições fisiológicas, de forma a aferir o envolvimento desta proteína na resposta celular ao stress oxidativa, e para expandir o interactoma dinâmico da DJ-1. Com esta metodologia, foi possível concluir que a proteína HADHA tem um interatoma dinâmico que é modelado pelo stress oxidativo. Diversas proteínas foram identificadas como interatores, pertencendo a diversos grupos funcionais, tais como proteínas do citoesqueleto, proteínas motoras, proteínas envolvidas na reparação do DNA e expressão de genes, e proteínas envolvidas em diferentes vias de sinalização. Além disso, muitas das proteínas identificadas como potenciais interatores da HADHA foram também anteriormente identificadas como interatores da DJ-1. A generalidade das proteínas quantificadas apresentou um aumento de interação com a HADHA em condições de stress oxidativo, fornecendo informações fundamentais sobre as suas funções biológicas associada à resposta celular a essa patologia, apontando para uma nova função da proteína HADHA relacionada com a proteção neuronal contra o stress oxidativo. Estes resultados contribuíram também para o aprofundar dos conhecimentos sobre a patogénese da doença de Parkinson, as potenciais vias envolvidas no despoletar da doença e a sua progressão, podendo fornecer novos potenciais alvos para o prognóstico, terapia e progressão da DP.

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease and the most common movement disorder, characterized by massive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc), leading to degeneration of nigrostriatal dopaminergic pathways. Evidence suggest several cellular dysfunctions important for pathogenesis in PD, including oxidative stress. Even though several efforts have been made to obtain a deeper knowledge of this disease, the etiology and pathogenesis still remain unclear. Nevertheless, there is an agreement that the majority of PD cases are sporadic and some rare cases have familial background. Indeed, mutations in several genes have been reported to cause hereditary forms of the disease, leading to valuable insights into the molecular mechanisms of neurodegeneration. Among the genetic forms, Dj1 gene was identified as an autosomal recessive gene responsible for familial early-onset PD, meaning that deeper knowledge on its physiological functions will provide important insights into molecular mechanisms of PD. Several functions have been attributed to DJ-1 protein, being its putative role in neuroprotection the most relevant, probably due to its involvement in protection against oxidative stress. Evidence indicate that DJ-1 operates at multiple levels and interact, directly or indirectly, with several partners. Although the mechanisms through which DJ-1 mediates neuroprotection is not fully understood, it seems to play a pivotal role in the mediation of signaling pathways and modulation of the oxidative metabolism. Several studies reported that indeed oxidative stress is the trigger condition for DJ-1 neuroprotective function, in a way that conformational changes to an oxidized form were pointed out as protein’s active form. Moreover, the stability of the majority of the interactions reported is also influenced by the oxidation state of DJ-1. A dynamic DJ-1 interactome screening was previously made in order to provide a comprehensive characterization of DJ-1 binding partners under oxidative stress conditions, leading to the identification of several binding partner. From those, proteins belonging to oxidoreductase family were identified, which are mainly associated with cellular response to oxidative stress, such as NDUFA4, PGDH and HADHA. However, such interactions still require validation. Based on this, complementary assays were performed to validate DJ-1 interaction with oxidoreductase proteins, such as immunoprecipitation, pull down assay, and immunocytochemistry followed by confocal analysis, in normal and oxidative stress conditions. iImunocytochemistry assay followed by confocal analysis of SH-SY5Y cells revealed that DJ-1 interacts with both PGDH and HADHA proteins in situ, thus confirming they are indeed binding partners. Moreover, pull down approach results suggested an interaction between HADHA and PGDH with recombinant WT DJ-1, which is modulated by oxidative stress., thus corroborating previous assumptions. After confirming HADHA as a DJ-1 bindings partner, an AP-SWATH approach was used to study HADHA interactome in SH-SY5Y cells exposed to normal and oxidative stress conditions, to assess this protein’s involvement in cellular response to oxidative stress, and to expand DJ-1’s dynamic interactome. With this methodology, it was possible to conclude that HADHA has a dynamic interactome that it is modulated by oxidative stress conditions. Several proteins were identified as binding proteins, like cytoskeleton proteins, motor proteins, proteins involved in DNA repair and gene expression, and in different signaling pathways. Moreover, some of the identified HADHA putative interactors were previously also identified as DJ-1 interactors. The majority ofproteins quantified showed an increased interaction with HADHA in oxidative stress conditions, thus providing insights into their biological functions in cellular response to such insult, pointing to a new HADHA role in neuronal protection against oxidative stress. Such results, also contribute to deeper knowledge on PD pathogenesis, the distinct pathways involved in the establishment and progression of the disease, highlighting potential new targets for PD prognosis, therapy and prevention.