Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera: Purificação parcial e Caracterização

Abstract

Cogumelos são reconhecidos como uma fonte promissora de novas proteínas. Várias proteínas com características únicas foram isoladas, incluindo enzimas lignocelulolíticas, lectinas, proteases, inibidores da protease e hidrofobinas. Fungos decompositores (sapróbios) como Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera produzem hidrolases para degradar o material lignocelulósico e celulolítico. Para degradar estes polímeros dispõem de um sistema enzimático complexo, composto por enzimas que podem ser secretadas, enzimas intracelulares e membranares. O micélio é a estrutura responsável por algumas funções importantes dos fungos, como a respiração, absorção, excreção e reprodução. Para além de fixar o substrato, o micélio tem como função a digestão extracelular. A digestão extracelular é conseguida pela secreção de proteínas para o meio envolvente, as hidrolases são algumas das proteínas secretadas pelos micélios. Desta forma o micélio é um alvo para a investigação de proteínas. O estudo da modificação das condições do meio de cultura é importante no sentido de se criarem as condições necessárias para a secreção de proteínas com interesse biotecnológico. Neste sentido foi feita uma caracterização do perfil proteico a uma dimensão e caracterização da actividade enzimática da secreção e do micélio de A. aegerita e M. procera ao longo de 10 dias de cultura O 8º dia foi tempo de cultura ideal em que a quantidade de proteína e actividade enzimática eram as ideais para ambas as espécies. Também foi feita uma estimulação da secreção de hidrolases pela adição de serradura de acácia e eucalipto e borras de café na proporção de 40 g/l. No entanto a nível das secreções não se verificou incrementos de actividade específica. Apenas a serradura de acácia parece ter estimulado o micélio de M. procera, levando a um aumento da actividade de algumas proteases e a um aumento de β-glucosidases. As proteínas presentes nas secreções foram concentradas por vários métodos no sentido de aumentar a quantidade de proteína e a actividade. As metodologias com melhores resultados foram a liofilização para a secreção de M. procera e a precipitação com sulfato de amónia para a secreção de A. aegerita. Porém, a quantidade de proteína e de actividade permaneceram baixas e insuficientes para a purificação de enzimas de um modo rentável.Uma vez que a concentração de proteína e actividade enzimática das secreções foi baixa, e insuficiente para a purificação de hidrolases, a separação de proteases foi realizada a partir do micélio. Deste material foram purificadas parcialmente proteases do tipo serínico e metaloaminopeptidases por cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose

Mushrooms are recognized as a promising source of novel proteins. Several proteins were isolated with unique features, including lignocellulolytic enzymes, lectins, proteases, proteases inhibitors and hydrophobins. Decomposer fungi (saprobes) as Agrocybe aegerita and Macrolepiota procera produce hydrolases to degrade lignocellulosic and cellulolytic material. To degrade these polymers, they have a complex enzyme system, composed of enzymes that can be secreted, intracellular enzymes and membranar enzymes. Mycelium is the structure responsible for some important functions of fungi, such as breathing, absorption, excretion and reproduction. In addition of the ability to fix the substrate, mycelium has extracellular digestion function. The digestion is achieved by the extracellular secretion of proteins into the surrounding environment; hydrolases are some of the proteins secreted by mycelium. Thus, the mycelium is a target for investigation of proteins. The study of the modification of the culture medium conditions is important in order to create necessary conditions for the secretion of proteins with biotechnological interest. In this study was performed a characterization of one dimension protein profile and characterization of the enzymatic activity of the secretion and mycelium extract of A. aegerita and M. procera over 10 days of culture. The optimum cultivation time was at 8th day wherein the amount protein and enzymatic activity were found optimal for both species. We also stimulate the secretion of hydrolases by the addition of acacia and eucalyptus sawdust and coffee grounds at a ratio of 40 g/l. However, increments of hydrolase specific activity in secretion was not observed. Acacia sawdust appears to have stimulated M. procera mycelium, leading to an increased activity of some proteases and an increase in β-glucosidase activity. Proteins present in secretion were concentrated in terms of quantity and activity. The best results were found to lyophilization of M. procera secretion and precipitation with ammonium sulfate of A. aegerita secretion. However, the amount of protein and activity remained low and insufficient for the purification of enzymes in a cost effective manner.