Modulation of receptors for advanced glycation endproducts network in Parkinson's disease

Abstract

A complexa relação entre quadros inflamatórios crónicos, provenientes de uma desregulação do sistema imune inato, e o processo neurodegenerativo associado à Doença de Parkinson (DP) é uma área emergente na comunidade científica. Através de um conjunto intricado de sensores imunes, onde os receptores dos produtos de glicação avançada (RAGE) aparentam desempenhar um papel preponderante, a imunidade inata regula a extensão e consequências da reacção inflamatória: é benéfica quando limitada no tempo mas podendo ser deletéria se perpetuada indefinidamente. Vários estudos post-mortem, clínicos e experimentais, evidenciam a acumulação de padrões moleculares associados a danos [Damage-associated molecular patterns – DAMP’s (e.g. S100B, HMGB-1)], RAGE e co-receptores da imunidade inata em diferentes regiões cerebrais afectadas pelo processo neurodegenerativo. Estas evidências sugerem que uma cascata de eventos deletérios mediada por RAGE possa estar sobreactivada na DP. No entanto, este receptor apresenta simultaneamente uma importante função em processos homeostáticos e regenerativos pelo que se torna imperioso identificar estratégias que anulem os seus efeitos deletérios sem compromisso das suas funções benéficas. Este delicado balanço será porventura bem-sucedido após a clarificação dos parâmetros biológicos que ditam a resposta mediada por RAGE, nomeadamente em contextos experimentais associados à DP. Assim, o objectivo principal deste trabalho consistiu na caracterização biológica que determina o fenótipo de RAGE, recorrendo a distintos regimes de intoxicação da neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) em modelos animais, que representam paradigmas experimentais da DP. A diversidade de isoformas RAGE é crucial para a regulação dos seus efeitos benéficos/deletérios. Efetivamente, a sinalização mediada por RAGE resulta da complexa combinação dos efeitos mediados por isoformas competentes no processo de sinalização (flRAGE) versus isoformas antagonistas [variantes truncadas (e.g. isoformas solúveis, sRAGE)]. Através da sua capacidade em sequestrar ligandos no espaço extracelular, as isoformas RAGE solúveis previnem a acumulação tóxica de ligandos, garantindo uma activação basal e trófica de flRAGE. No entanto, quadros caracterizados por stress oxidativo e inflamação crónica potenciam a acumulação de ligandos, perpetuando cascatas intracelulares de sinalização deletéria mediada por RAGE, com o aumento da sua expressão e subsequente sinalização inflamatória. Assim, a primeira abordagem experimental deste trabalho consistiu na caracterização das isoformas RAGE e do seu ligando S100B no estriado de murganhos C57BL/6 submetidos a distintos protocolos de intoxicação sistémica (aguda e crónica) de MPTP. Esta estratégia permitiu-nos primeiramente observar que, num modelo de intoxicação crónico, níveis proteicos basais de S100B/flRAGE (considerados neurotróficos) e uma predominante expressão de flRAGE neuronal acompanham processos compensatórios (e.g. aumento do turnover de dopamina) recrutados como resposta à disrupção do sistema dopaminérgico estriatal em murganhos sem compromisso motor. Este fenótipo potencialmente protector motivou-nos a fazer uma caracterização completa das isoformas RAGE numa fase inicial de degenerescência dopaminérgica no estriado, induzida por um protocolo de intoxicação aguda de MPTP. Neste segundo paradigma experimental, observámos o aumento da expressão de isoformas inibitórias de RAGE. No entanto, encontrámos teores basais de isoformas sinalizadoras. Esta regulação potencialmente citoprotectora ocorreu em astrócitos pre-hipertróficos, exibindo sobreexpressão do ligando S100B. Estes resultados sugerem a activação de processos regulatórios conducentes a um perfil citoprotector de RAGE na lesão dopaminérgica estriatal, em fases prémotoras do processo neurodegenerativo. A complexidade da sinalização citoprotectora/citotóxica mediada por RAGE aumenta com o recrutamento de outros receptores de padrões moleculares (PRR’s), nomeadamente os receptores da família Toll (TLR’s). Tendo em conta que os DAMP’s são reconhecidos por ambas as classes de receptores, a acumulação destes ligandos despoleta a activação de tríades funcionais formadas por DAMP’s/RAGE/TLR’s, exacerbando quadros inflamatórios com subsequente dano celular/tecidular. Neste contexto, a estratégia experimental seguinte consistiu num estudo abrangente de transcrição génica visando DAMP’s, RAGE e TLR’s, bem como efectores da imunidade inata. Foram incluídas nesta terceira abordagem experimental regiões cerebrais associadas a défices cognitivos e emocionais (e.g. hipocampo, córtex frontal), sintomatologia característica da fase prodrómica da DP. Numa fase pré-motora de um modelo de administração intranasal (i.n.) de MPTP a ratos Wistar, observámos uma supressão selectiva da transcrição de RAGE e outros elementos chave da imunidade inata (e.g. TLR5,7 e subunidade p22 do complexo NADPH oxidase) no córtex frontal de animais intoxicados por MPTP, e que apresentavam défices comportamentais do foro cognitivo e emocional. Este padrão coordenado de expressão génica sugere a activação precoce de mecanismos de retro-controlo como tentativa de regular a resposta imunitária, prevenindo assim um excesso de reatividade imunitária e inflamação. Por fim, recorremos a este mesmo paradigma experimental para avaliar a capacidade do exercício físico (EF) em modular centralmente o eixo RAGE e o fenótipo cognitivo e emocional. Neste contexto, observámos uma imunossupressão de RAGE, TLR’s e efectores do sistema imune no córtex frontal de ratos sujeitos a um protocolo aeróbico de longa duração, em passadeira. Este perfil imunitário não se repercutiu em alterações de fenótipo não motor. Surpreendentemente, constatámos que ratos intoxicados com MPTP (i.n.) e submetidos ao mesmo protocolo de EF, recuperaram a expressão do eixo RAGE e aumentaram a expressão do gene neuroprotector DJ-1. Esta modulação imunitária acompanhou a recuperação dos défices cognitivos e emocionais observados nos ratos sedentários e intoxicados. Estas observações constituem um importante avanço dado que o conhecimento do impacto do EF no sistema neuroimune é manifestamente insuficiente num contexto fisiológico, e praticamente desconhecido na DP. Em suma, as evidências observadas nos diferentes paradigmas experimentais implementados neste estudo convergem para um fenótipo citoprotector de RAGE em estadios inicias da DP. Abordagens complementares que identifiquem i) os mecanismos regulatórios subjacentes à repressão do fenótipo citotóxico de RAGE e ii) estratégias moduladoras das isoformas RAGE, priveligiando selectivamente as variantes citoprotectoras, são indispensáveis. Paralelamente, é desejável o aprofundamento da avaliação funcional da adaptação imunitária do eixo RAGE no córtex frontal promovida pelo EF, nomeadamente em estadios iniciais da DP. Este trabalho encoraja a existência de estudos complementares na esperança de se poder desenhar estratégias inovadoras na terapêutica da DP.

A burgeoning research field in Parkinson’s disease (PD) relies on the complex relationship between deregulated innate inflammation and neurodegenerative process. Through an elaborate network of immune sensors where receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) seems to play a chief-regulatory role, innate immune system is strongly implicated in the fine regulation of the best balance between acute resolution of injury versus chronic amplification of noxious pathways. Strong evidence from humans and experimental PD settings points towards the accumulation of danger associated molecular patterns [DAMP’s, (e.g. S100B, HMGB-1)], RAGE and immune co-receptors in distinct affected brain regions, strongly suggesting that an operative RAGE network participates in neurodegeneration. Yet, RAGE is simultaneously a central player in homeostasis maintenance and tissue regeneration upon shortlimited injury. This “friend or foe” behavior suggests that strategies aiming to retain primal RAGE responses to stress, yet derailing deleterious RAGE outcomes would be of utmost importance in PD. Such fine tuning regulation can be achieved only with an in-depth understanding of RAGE biology in PD settings. Hence, the broad aim of this thesis is to provide a global characterization of key-aspects of RAGE biology using distinct neurotoxin-based 1- methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) rodent models that experimentally replicate specific features of early PD. The diversity of RAGE isoforms is pivotal in dictating RAGE protective or deleterious outcomes. In fact, when one speaks of RAGE signaling, one is referring to an outcome that results from the interplay between signaling-competent full length RAGE (flRAGE) and antagonistic RAGE isoforms [truncated RAGE variants (e.g. soluble RAGE, sRAGE)]. By acting as decoy receptors, sRAGE prevents RAGE ligands accumulation (e.g. S100B) thereby maintaining a low-grade of flRAGE trophic signaling. Conversely, chronic inflammatory/oxidant settings favor ligands accumulation with subsequent noxious flRAGE upregulation. Hence, we initially addressed RAGE protein isoforms and its S100B ligand in longlasting versus short-limited MPTP stressed striata (chronic and acute MPTP models, respectively). We newly provide experimental evidence showing neurotrophic S100B/flRAGE contents and major neuronal RAGE localization pairing compensatory changes (e.g. increased dopamine turnover) in chronic stressed striata from mice showing normal locomotor behavior. This seemingly beneficial outcome prompted us to further dissect the overall balance of striatal RAGE variants shortly after acute MPTP. Noticeably, we found increased inhibitory RAGE variants combined with normal flRAGE contents. Regulation of RAGE isoforms towards a cytoprotective phenotype occurred in pre-hypertrophic astrocytes showing higher S100B density. These findings seem to converge towards RAGE trophic outcomes within MPTP striatal dysfunction, an early event of dopaminergic neurodegenerative process that classically characterizes PD. The fine tuning of repair/injury balance also involves RAGE cross-talk with other immune sensors, namely Toll-like receptors (TLR’s). Since DAMP’s are recognized by both class of receptors, accumulation of these ligands foster signaling pathways amplification through DAMP’s/RAGE/TLR functional tripods engaged in exacerbated innate inflammation and injury. Hence, we underwent a comprehensive transcriptomic approach of ligands, RAGE, TLR’s and intracellular effectors of immune response. We extended this study to frontal cortex and hippocampi regions regarding their role in cognitive and emotional deficits that typically characterizes PD prodromal phase. In a pre-motor phase of intranasal (i.n.) MPTP model, cognitive/emotionally impaired MPTP-animals showed a selective regional transcriptomic suppression of RAGE and core components of innate immunity (e.g. TLR5,7 NADPH oxidase p22-subunit) in frontal cortex. This coordinated expression pattern suggests counter-regulatory mechanisms aimed to restrain central innate immune response towards homeostasis. Finally, we used i.n. MPTP model to experimentally address the aptitude of physical exercise (PE) to modulate central neuroimmune RAGE-network while correcting MPTP elicited cognitive/emotional deficits. One of the most impressive findings of the present work is the selective and robust immunosuppression of RAGE, large majority of TLR’s and immune effectors in frontal cortex of long-term treadmill-trained rats displaying normal behavioral phenotype. Noticeably, an almost recovery of neuroimmune RAGE-network and a significant up-regulation of neuroprotective PD-related gene DJ-1 paralleled normal cognitive and emotional/motivational phenotypes of trained-MPTP subjects. These findings reflect an important advancement in the research field as experimental data on the impact of PE on brain immune mediators is extremely scarce in physiological contexts, being almost ignored in PD pathology. Overall, findings from all experimental paradigms are convergent and strongly suggest that RAGE has a protective rather tissue-destructive phenotype in early stages of PD neurodegeneration. Additional research is warranted to further dissect the regulatory mechanisms underpinning neuroimmune RAGE-network transcriptomic as well as strategies to specifically modulate RAGE variants towards cytoprotective isoforms in experimental PD. Besides, future studies should evaluate the functional consequences of RAGE/TLR’s/immune effectors adaptation in frontal cortex associated with PE, particularly in early stages of PD. Hopefully, this will bring new innovative strategies for the disease.