Correlating biological activity and chemical fingerprint: raman microspectroscopy studies in human breast cancer cells-

Abstract

O cancro de mama é atualmente uma das principais causas de morte entre as mulheres em todo o mundo (e o segundo tipo de cancro mais mortal em Portugal), podendo ser provocado por condições de stresse oxidativo. O desenvolvimento de agentes quimiopreventivos contra este tipo de neoplasia é assim da maior relevância, com vista a reduzir a incidência desta patologia induzida por stresse oxidativo. Os compostos fitoquímicos (como os ácidos hidroxicinâmicos e as isoflavonas) são uma importante fonte de antioxidantes presentes na dieta. São responsáveis por uma diminuição considerável dos efeitos nocivos de espécies oxidantes no nosso organismo, constituindo assim um grupo promissor de potenciais agentes quimiopreventivos face a processos carcinogénicos. O objectivo deste trabalho é o estudo de dois antioxidantes da dieta – ácido pcoumárico (p-Ca, um ácido fenólico monohidroxilado) e daidzeína (DA, uma isoflavona) – como potenciais agentes quimiopreventivos, utilizando como modelo biológico as linhas celulares humanas da cancro de mama MCF-7 (dependente de estrogénio) e MDA-MB231 (independente de estrogénio). Foi seguida uma estratégia multidisciplinar, que combinou ensaios biológicos com técnicas de ponta de espectroscopia vibracional, para avaliar (a distintas concentrações e para um tempo de exposição aos compostos de 48 h): (i) a proliferação celular/viabilidade, através dos testes colorimétricos de SRB e MTT; (ii) a capacidade antimetastática, usando uma câmara de invasão “transwell”; (iii) a formação de espécies ROS/RNS, mediante uma técnica fluorimétrica (com a sonda 2ʹ,7ʹdiclorofluoresceína diacetato); (iv) o impacto metabólico ao nível celular via microespectroscopia de Raman em células fixas. Em particular, a técnica de microRaman aplicada a culturas celulares permite uma monitorização rigorosa e não invasiva de amostras biológicas, constituindo uma ferramenta preciosa e inovadora para a avaliação do efeito de agentes externos no perfil bioquímico intracelular. Para as concentrações de 50 e 100 μM, o p-Ca demonstra ter capacidade de aumentar significativamente a viabilidade celular para MDA-MB-231, porém os resultados de Raman não mostram nenhuma diferenciação entre o controlo e as células tratadas. Em contraste, as concentrações de 7.5 e 15 μM de p-Ca induzem uma pequena diminuição da viabilidade, porém os espectro de Raman exibem modificações a nível da composição química (maioritariamenta lípidos e proteínas). Para as MCF-7, o p-Ca não demonstrou ter qualquer efeito significativo (em todos os intrevalos de concentrações) quer nos ensaios biológicos como para microscopia de Raman. As medições de ROS/RNS concordam com estas conclusões, e evidenciam a seletividade demostrada pelos polifenóis em estudo. Para a daidzeina, a concentração de 100 μM de daidzeina reduz a viabilidade celular (aproximadamente 50%) para a linha celular MDA-MB-231, os resultados de Raman evidenciam diferenças nos lípidos e no conteúdo proteíco. Para as MCF-7, a viabilidade é reduzida (30% e 40%) para 50 e 100 μM, confirmado por microRaman Em conclusão, os resultados obtidos para 50 e 100 μM p-Ca permitem hipotetizar sobre o efeito pro-oxidante do ácido fenólico neste tipo de células (dando enfase às concentrações mais elevadas), o aumento dos níveis intracelulares de ROS levam ao aumento da proliferação neoplasica (que se sabe estar associada à necessidade de ROS). Em concentrações mais baixas, os compostos demonstram interagir com os lípidos, podendo vir a ser uma promissora estratégia quimiopreventiva para carcinogéneses induzidas por alterações nos lípidos provocadas por ROS.

Breast adenocarcinoma is one of the major causes of death among women worldwide (the second most lethal cancer type in Portugal) and can be caused by oxidative stress conditions. The development of chemopreventive agents against this type of neoplasia is therefore of the utmost importance, in order to reduce the risk of this type of oxidative stress-related diseases. Phytochemicals (such as hydroxycinnamic acids and isoflavones) are an abundant source of antioxidants present in our daily diet known to significantly decrease the harmful effect due to oxidative species, and therefore being promising chemopreventive agents towards carcinogenesis. The present work aims at assessing two dietary antioxidants – p-coumaric acid (pCa, a monohydroxylated phenolic acid) and daidzein (DA, an isoflavone) – as potential chemopreventive agents, using as biological models the human breast cancer cell lines MCF-7 (estrogen-dependent) and MDA-MB-231 (estrogen-independent). A multidisciplinary approach was followed, coupling biological assays to cutting-edge vibrational spectroscopy techniques, to evaluate (for distinct concentrations, at 48 h exposure time): (i) cell proliferation/viability, by the SRB and MTT colorimetric tests; (ii) antimetastatic ability, using a transwell invasion chamber; (iii) generation of ROS/RNS species, through a fluorimetric technique (2ʹ,7ʹ-dichlorofluorescin diacetate probe); (iv) metabolic impact at the cellular level via Raman microspectroscopy of fixed cells. MicroRaman of cell cultures, in particular, allows an accurate and non-invasive probing of biospecimens, constituting an invaluable and innovative method for monitoring the effect of an external agent on the intracellular biochemical profile. At both 50 and 100 μM, p-Ca was found to induce a significant increase in cell viability for MDA-MB-231, although the Raman data did not show a clear differentiation between the control and the treated cells. In contrast, at 7.5 and 15 μM p-Ca induced a slight viability decrease, the Raman spectra having reflected changes in the cellular chemical composition (mostly in lipids and proteins). For the MCF-7 cells, p-Ca did not show any significant effect (in the whole concentration range tested) through either biological assays or Raman microspectroscopy. The ROS/RNS measurements corroborated these conclusions, and evidenced a striking cell-selectivity for both polyphenols studied. Regarding daidzein, a 100 μM dosage led to a marked decrease in cell viability (ca. 50%) for the MDA-MB-231 line, the Raman data evidencing differences in the lipid and protein content. For the MCF-7 cells, viability was found to decrease considerably (30% to 40%) for 50 and 100 μM concentrations, which was corroborated by microRaman. In conclusion, the results gathered for 50 and 100 μM p-Ca allow us to hypothesise on a pro-oxidant effect of the phenolic acid on this type of cancer cells (mainly for the highest concentration tested), the increased intracellular levels of ROS leading to an enhanced neoplastic proliferation (which is known to be associated with a need for ROS). At low concentrations, the compounds appear to affect mostly lipids which could be a promising chemoprotective strategy towards ROS-induced lipid damage associated to carcinogenesis. DA, in particular, was shown to be a promising chemoprotective agent against hormone-dependent breast adenocarcinoma. In addition, both dietary polyphenols can be envisaged as potential agents in adjuvant therapy for non-hormone dependent breast cancer.