Cardiac Tissue Constructs for Drug Screening

Abstract

Few examples have reported the successful use of engineered cardiac tissue for drug screening/toxicology assessment. This issue is of paramount importance since cardiac toxicity has been implicated in 28% of drug withdrawals over the last 30 years (Gwathmey et al., 2009). The development of tissue engineered cardiac tissue for drug screening requires the development of scaffolds that can be easily produced, flexible, small, and preserve the long-term contractility of cardiomyocytes, ideally in the absence of complex external electrical stimulation apparatus. Here we developed a flexible scaffold relatively easy to prepare that reproduces aspects of cardiac ECM, and can preserve the contractility of fetal rat cardiomyocytes for high-throughput drug screening applications. The scaffold is formed by a nanofilm of poly(caprolactone) (NF) coated by piezoelectric microfibers (PIEZO) composed of poly(vinylidene fluoride–trifluoroethylene) (PVDF-TrFE). When a mechanical force is applied to a piezoelectric material a shift or rotation of the constitutive dipole crystals occurs resulting in the generation of an electric charge. Therefore, PIEZO fibres may act as Purkinje cells, which in the native heart tissue are responsible for initiating and synchronizing cardiac beatings. To evaluate whether NF+PIEZO scaffolds preserve CM contractility, the number of spontaneous synchronous beatings per minute was monitored at day 1 and 12 after seeding the cells. While the average rate of beats in cells cultured in poly(styrene) and NF scaffolds maintained constant from day 1 to day 12, a significant increase in beats/minute of the cells cultured on NF+PIEZO scaffolds was observed (from 18 to 106 beats/min). This indicates that, for at least 12 days, NF+PIEZO scaffold provided a better environment to preserve the spontaneous contractility of CMs. Alongside, cells cultured in NF+PIEZO scaffold displayed higher levels of functional connexin 43 and waveform-like electrochemical signalling. These observations denote the stimulation of proper cell-cell communication and action potential conduction. When compared to tissue culture poly(styrene), the piezoelectric scaffold promoted transmembrane transients of Ca2+. This was confirmed by a high concentration of intracellular Ca2+ and a higher expression of important ion channels, namely sub-units of L-type Ca2+ channels and human Ether-à-go-go-Related ion channels. These observations were accompanied by clear morphological changes when compared to poly(styrene), including a 3-fold increase in CM alignment, more organized sarcomeric structures and a higher CM surface area. In addition, a main component of the contractile machinery (α-cardiac actin) was up-regulated, while its fetal counterpart (α-skeletal actin) dropped significantly in the piezo scaffold. To evaluate the usefulness of the engineered cardiac construct for drug screening, the cell construct was tested with norepinephrine. The results showed an adequate chronotropic response denoted by the rise of intracellular Ca2+ concentration which was accompanied by an increase in beating rates. Finally, metabolic studies based on glucose consumption and lactate production demonstrated that CMs cultured in NF+PIEZO had more efficient aerobic metabolism. This profile is inverted in the presence of doxorubicin, a cardiotoxic drug, which forces CMs to a glycolytic (anaerobic) metabolism and induces cell death. Overall, the results present in this thesis highlight the advantages of a piezoelectric-based scaffold to develop cardiac constructs for cardiotoxicity assessment.

Poucos estudos reportam a utilização bem-sucedida de tecido cardíaco criado in vitro na análise de efeitos farmacológicos e toxicológicos de medicamentos. Esta falha é de extrema importância, visto que toxicidade cardíaca tem sido implicada em cerca de 28% das remoções de medicamentos do mercado nos últimos 30 anos (Gwathmey et al., 2009). O desenvolvimento de tecido cardíaco in vitro para screening de medicamentos requer o desenvolvimento de matrizes que sejam facilmente produzidas, flexíveis, de pequena dimensão e preservem a contractilidade a longo termo de cardiomiócitos, idealmente na ausência de sistemas complexos de estimulação eléctrica. Aqui é descrito o desenvolvimento de uma matriz flexível para screening de medicamentos que é de fácil produção, reproduz aspectos da matriz extracelular cardíaca e permite a preservação da contractilidade de cardiomiócitos fetais de rato. A matriz é constituída por um nanofilme de poli(caprolactona) (NF) revestido por microfibras piezoeléctricas (PIEZO) de poli(vinilideno-trifluoroetileno) (P(VDF-TrFE)). Quando uma força mecânica é aplicada sobre o material piezoeléctrico ocorre uma alteração ou rotação nos dipolos cristalinos constitutivos, resultando na geração de uma carga eléctrica. Assim, fibras piezoeléctricas podem actuar como células de Purkinje, que no tecido cardíaco nativo são responsáveis por iniciarem e sincronizarem os batimentos cardíacos. Para avaliar se a matriz de NF+PIEZO preservaria a contractilidade de cardiomiócitos, o número de batimentos sincronizados por minutos foi monitorizado ao 1º e 12º dia após semear as células. Enquanto que a média de batimentos nas células cultivadas em poli(estireno) e em NFs foi semelhante no 1º e 12º dia, um aumento significativo foi observado (de 18 para 106 batimentos/min) nas células cultivadas nas matrizes de NF+PIEZO. Isto indica que, pelo menos até 12 dias, a matriz de NF+PIEZO oferece um microambiente melhor para a preservação da contracção espontânea de cardiomiócitos. Paralelamente, as células cultivadas nas matrizes de NF+PIEZO apresentaram níveis superiores de conexina 43 funcional e uma sinalização electroquímica em forma de onda. Estas observações denotam o desenvolvimento adequado da comunicação intercelular e do potencial de acção. Quando comparado com tecido cultivado em poli(estireno), a matriz piezoeléctrica promoveu o desenvolvimento de transientes de Ca2+, como foi confirmado pelos níveis elevados de Ca2+intracelular e pela elevada expressão de canais iónicos relevantes, nomeadamente sub-unidades de canais de Ca2+ tipo-L e canais Ether-à-go-go-Related. Estes resultados foram acompanhados por claras alterações morfológicas que incluíram um aumento de 3 vezes no alinhamento de cardiomiócitos, a presença de estruturas sarcoméricas alinhadas, e uma área de superfície de cardiomiócitos superior do que na condição controlo. Adicionalmente, a expressão de um dos componentes da maquinaria contráctil (α-actinina cardíaca) foi aumentada, enquanto que o respectivo homologo fetal (α-actinina esquelética) diminuiu significativamente na matriz piezoeléctrica. De forma a avaliar a utilidade do tecido cardíaco criado in vitro no screening medicamentos, o tecido celular construído foi testado com noradrenalina. Os resultados demonstram uma resposta cronotrópica adequada, evidenciada pelo aumento da concentração intracelular de Ca2+ acompanhado por um incremento no ritmo de batimento. Para finalizar, estudos metabólicos baseados no consumo de glucose e na produção de lactato demonstraram que os cardiomiócitos cultivados nas matrizes de NF+PIEZO apresentam um metabolismo aeróbico mais eficiente. Este perfil é invertido na presença de doxorubicina, um agente farmacológico cardiotóxico que força cardiomiócitos a adquirirem um metabolismo glicolítico (anaeróbico) e induz morte celular. Em suma, o conjunto de resultados apresentados nesta tese evidenciam as vantagens que uma matriz baseada num material piezoeléctrico apresenta no desenvolvimento de tecidos in vitro para a análise de efeitos cardiotóxicos.