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Title: Role of mitochondria and DNA damage responses in cancer stem cells resistance to chemotherapy
Authors: Mesquita, Katia de Almeida 
Orientador: Vega-Naredo, Ignacio
Duarte, Emília
Keywords: Cancer stem cell; CSCs; Cisplatin; DNA damage; Células estaminais tumorais; Cisplatina; Etoposídeo; Doxorubicina; Danos no DNA
Issue Date: 27-Jan-2016
Citation: MESQUITA, Katia de Almeida - Role of mitochondria and DNA damage responses in cancer stem cells resistance to chemotherapy. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/29627
Abstract: Um tumor é constituído por diferentes tipos de células, entre as quais as células estaminais tumorais. Células estaminais tumorais apresentam características únicas como rápida proliferação, plasticidade e pluripotência, tornando-as de elevado interesse clínico. As células estaminais tumorais são assim apontadas como sendo células iniciadoras de tumores bem como responsáveis da reincidência da doença. É também consensual que as células estaminais tumorais são mais resistentes às terapias convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, quando comparando com a população heterogénea de células tumorais normais. Este trabalho pretendeu esclarecer as características desta subpopulação de células estaminais tumorais e o que as tornam mais resistentes à morte celular quando comparando com as células mais diferenciadas. O modelo celular que usámos, células P19 de carcinoma embrionário tem como vantagem a utilização de uma só linha celular, podendo-se obter células P19 estaminais de carcinoma (P19SCs) ou células P19 de carcinoma mais diferenciado (P19dCs) que nos permitirão investigar diferentes resultados observados relativamente ás terapias cancerigenas. Como tal, pretendemos verificar as diferenças fisiológicas mitocondriais bem como a sua capacidade de resistir e detectar danos de DNA, factores que contribuem para a resistência à morte celular das P19SCs quanto comparadas com as P19dCs. A mitocôndria está ligada a diversos processos celulares para além do seu papel na produção de energia. Neste trabalho, a mitocôndria demonstrou ser crucial nos processos celulares de heterogeneidade, de auto-renovação e de diferenciação, processos chaves no potencial tumorogénico das células cancerígenas. De facto, existe uma relação entre o metabolismo e o destino celular escolhido. As células alteraram as suas preferências metabólica, bem como a proliferação, auto-renovação e diferenciação a fim de minimizar o stress, manter um potencial estaminal máximo e estimularem a sobrevivência. P19SCs demonstraram ser essencialmente glicolíticas no processo de obtenção de energia e apresentaram mitocôndrias de características distintas. Quando forçadas a mudar o seu metabolismo energético para um metabolismo mais oxidativo, um processo de diferenciação é iniciado com consequente redução da proliferação celular. Neste trabalho as drogas quimioterapêuticas cisplatina, etoposídeo e doxorubicina foram utilizadas como agentes de danos de DNA, de modo a estudarmos a resistência das células estaminais cancerígenas, bem como esclarecer que vias podem estar envolvidas nesta resistência descrita na literatura. Com o nosso trabalho verificámos que cada uma destas drogas têm diferentes tipos de efeitos nas células P19SCs e nas P19dCs. De facto, as células mais diferenciadas parecem ser mais afectadas por todas as drogas (mais danos de DNA) em que o mecanismo de apoptose dependente da via das caspases se encontra activo. As P19SCs tratadas com doxorubicina parecem igualmente afectadas quando comparando com as P19dCs, demonstrando que, contrariamente ás outras duas drogas testadas, a doxorubicin provoca danos mais severos, até mesmo para as P19SCs. Nas P19SCs tratadas com cisplatina que não apresentam danos de ADN de cadeia dupla (mais severos) e que estão presentes nas células mais diferenciadas, vias como paragem no ciclo celular, activação da proteína PARP-1 envolvida na reparação celular, bem como a activação do mecanismo de autofagia (mecanismos não observados nas células mais diferenciadas), contribuem para a resistência destas aos danos de ADN provocados pela cisplatina (maioritariamente danos de cadeia simples). Para além destas vias, um mecanismo de diferenciação e manutenção do potencial de pluripotência pode também estar associado ao mecanismo de resistência. Nas P19SCs tratadas com etoposídeo que não apresentam danos de ADN de cadeia dupla (mais severos) detectados nas P19dCs, apesar da paragem do ciclo celular ser igual em ambas os tipos de células estudadas, a expressão da proteina PARP-1 bem como o mecanismo de autofagia estar activo contribuem para a resistência destas aos danos de ADN provocados pelo etoposídeo. Aliás a resistência das células estaminais ao etoposídeo pode passar pela manutenção do potencial de pluripotência. Em conclusão podemos afirmar que as P19SCs e as P19dCs reagem de modo diferente a cada umas das drogas, e que estas diferenças podem justificar e esclarecer a resistência das células estaminais tumorais a um dos tratamentos mais utilizados no cancro, a quimioterapia.
Cancer stem cells (CSCs) are amongst the heterogeneous group of cells constituting tumors. CSCs present unique characteristics such as their high proliferative ability, plasticity and pluripotency, making these cells clinically relevant. In recent years, CSCs have been pointed out as tumor initiators and as responsible for disease recurrence. Moreover, is also consensual that CSCs are more resistant to conventional anti-cancer therapies, namely chemotherapy and radiotherapy, when compared with other cells constituting the tumor. This work was designed to clarify the characteristics that turn this subpopulation of cells more resistant to cell death when compared to their differentiated counterparts. To achieve this, we used P19 embryonic cancer cells that constitute a great model as it allows the study to be performed with a single cell line from which one can obtain both P19 cancer stem cells (P19SCs) and P19 differentiated cancer cells (P19dCs). By working with these P19 cell groups, we intended to investigate the distinct outcomes when applying different anti-cancer therapies. In this regard, our study focused on the identification of the main mitochondrial physiological alterations between P19dCs and P19SCs, as well as the characterization of each cell group capacity to resist and detect DNA damage. This knowledge comes with high relevance as together these attributes are thought to contribute to CSCs resistance to cell death. In addition to their role in energy production, mitochondria have been associated with important roles in different cell processes. Along this work, this organelle was shown to be crucial in heterogeneity cell processes, self-renewal, and differentiation, all of which contribute for the tumorigenic potential of cancer cells. Our results support the existence of a link between metabolism and cell faith. Cells were shown to alter their metabolic preferences, proliferation as well as selfrenewal and differentiation in order to minimize stress, maintain a maximum stemness potential and stimulate survival. P19SCs exhibited a more glycolytic metabolism and mitochondria from this cell group had particular characteristics that, when forced to an oxidative metabolism, leads to the initiation of a differentiation process resulting in a reduction of cell proliferation. The study of CSCs resistance to chemotherapeutic drugs was performed with cisplatin, etoposide and doxorubicin aiming the characterization and clarification of the pathways involved in the resistance described in the literature. Interestingly, the obtained results revealed that each one of the drugs used in the study hads different effects in P19SCs when compared to P19 cells differentiated with retinoic acid. In fact, differentiated cells were more affected by the drugs used as these cells present more DNA damage, in which caspase-dependent apoptosis pathway was activated. P19SCs were similarly affected to doxorubicin treatment when compared to P19dCs, revealing that in contrast to the other drugs used, cell damage induced by doxorubicin may be too severe impairing P19SCs resistance ability. Nevertheless, in contrast with more differentiated cells, P19SCs treated with cisplatin did not present double strand DNA damage, highly severe. Furthermore, mechanisms such as cell cycle arrest, PARP-1 activation, which is associated with cell repair, and autophagy activation, were not observed in P19dCs in contrast to P19SCs suggesting that the described mechanisms may contribute for the later cell group resistance to cisplatin-induced DNA damage. Additionally, the maintenance of a pluripotency potential or even a diferentiation processess might also be related with P19SCs resistance to cisplatin.. Similarly to our observations for cisplatin, etoposide treatment did not result in double strand DNA damage in P19SCs, however these cells showed identical cell cycle arrest pattern to their differentiated counterparts. Despite this similarity, P19SCs have higher PARP-1 expression, which together with autophagy activation might explain the observed resistance to DNA damage upon treatment with etoposide. Additionally, the maintenance of a pluripotency potential might also be related with P19SCs resistance to this drug. In summary, we conclude that P19SCs operate differently when subjected to distinct treatments and when compared to P19dCs. Overall, our observations allow for a better knowledge of the mechanism involved in cancer stem cell resistance to chemotherapeutics as it allows the understanding of the described resistance of cancer stem cells to anti-cancer treatments applied.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Toxicologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/29627
Rights: openAccess
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