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Title: Oxidative stress versus epeginetics - Role in susceptibility, development, and progression of myeloid neoplasms
Authors: Gonçalves, Ana Cristina Pereira
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Costa, José Manuel Nascimento
Vieira, Luisa Mota
Keywords: Acute myeloid leukemia
Disease susceptibility
DNA methylation
Genetic variants
Biomarkers
Mitochondrial membrane potential
Myelodysplastic syndrome
Oxidative stress
Prognosis
Tumor suppressor genes
Issue Date: 18-May-2016
Citation: GONÇALVES, Ana Cristina Pereira - Oxidative stress versus epeginetics : role in susceptibility, development, and progression of myeloid neoplasms. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/29610
Abstract: Myeloid neoplasms (MN) are a group of heterogeneous diseases that includes myelodysplastic syndromes (MDS), myeloproliferative neoplasms (MPN), and acute myeloid leukemia (AML). These diseases can simultaneously harbor changes in reactive oxygen species (ROS) levels and in DNA methylation pattern. The oxidative stress (OS) results from the imbalance between ROS production, mainly in mitochondria, and their elimination by antioxidants. Moreover, MN recurrently show abnormal hypermethylation of tumor suppressor genes (TSG), such as P15 and P16 genes, and in less extent global hypomethylation of repetitive sequences such as long interspersed nucleotide elements 1 (LINE-1). The present study aimed to analyze the involvement of OS and DNA methylation in the development and progression of MN, in order to evaluate their role as diagnostic and prognostic markers, as well as to identify susceptibility variants in genes involved in these mechanisms. Frist, we conducted a proof of concept study to investigated the involvement of OS and mitochondrial dysfunction in MDS pathogenesis, as well as to assessed their diagnostic and prognostic value, and the relation of OS parameters (intracellular levels of peroxides, superoxide, and reduced glutathione – GSH) with methylation status of P15 and P16 gene promoters. To that end we used two technique: flow cytometry and methylation specific-PCR (MSP). We observed that bone marrow cells from MDS patients had higher peroxide levels and lower GSH content than control cells. Moreover, OS levels were dependent of MDS subtype and risk group. GSH showed to be an accurate MDS diagnostic marker, while ROS, GSH, and superoxide/peroxides ratio were good survival markers. MDS patients had higher P15 and P16 methylation frequencies than controls. Moreover, patients with methylated P15, P16, and P15 or P16 had higher OS levels than patients without methylation. To confirm these results, we expanded the evaluation of OS (several enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses; oxidative damage) and DNA methylation parameters [localized DNA methylation – methylation status of P15, P16, TP53, MGMT, DAPK, and KEAP1 genes; global DNA methylation – levels of 5-methylcytosine (5-mC), 5-hydroxymetylcytosine (5-hmC), and LINE-1 methylation], as well as the studied pathologies (MDS and MPN). These biological parameters were evaluated in peripheral blood samples by colorimetry and fluorimetry assays, as well as by MSP and combined bisulfite restriction analysis (COBRA). MDS patients had lower levels of GSH and TAS (total antioxidant status), as well as higher levels of peroxide, peroxide/GSH, and peroxide/TAS than controls. Moreover, MDS and MPN patients had higher 5-mC levels and lower 5-hmC/5-mC ratio, as well as increased methylation of at least one methylated gene (P15, P16, DAPK, or KEAP1). TP53 and MGMT genes were unmethylated in these patients. Peroxide levels and peroxide/GSH ratio were higher in patients with methylated genes than in those without methylation. LINE-1 methylation and 5-mC levels were correlated with peroxide levels and peroxide/GSH ratio. Next, we assessed the association of variants of genes involved in OS, folate metabolism, DNA repair, and DNA methylation with the susceptibility and prognosis of MDS and AML. To that end, 16 SNPs (one per gene: CAT, CYBA, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, GPX1, KEAP1, MPO, MTRR, NEIL1, NFE2F2, OGG1, SLC19A1, SOD1, SOD2, and XRCC1) were genotyped by PCR techniques. We also analyzed OS (ROS/TAS), DNA damage (8-OHdG), and DNA methylation (5 mC) in a sub-cohort of MDS patients and controls. Results showed that five genes (GPX1, NEIL1, NFE2L2, OGG1, and SOD2) were associated with MDS, two (DNMT3B and SLC19A1) with AML, and two (CYBA and DNMT1) with both diseases. OS levels were correlated with CYBA, GPX1, and SOD2 genotypes, DNA damage with NEIL1 and OGG1, and 5-mC levels with DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, and MTRR. Furthermore, DNMT3A, MTRR, NEIL1, and OGG1 variants modulated AML transformation in MDS patients. Additionally, DNMT3A, OGG1, GPX1, and KEAP1 variants influenced MDS and AML survival. Finally, we investigated if acute and chronic exposure to hydrogen peroxide (H2O2) affects the methylome of normal and malignant hematological cells. In this investigation, we used four acute myeloid leukemia cell lines and a normal B lymphocyte cell line, and analyzed the copy number and methylation status of several TSG, LINE 1 methylation, levels of 5-mC, 5-hmC, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), ROS, and GSH, as well as the gene expression of DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MECP2, MBD1, HDAC1, EZH2, EP300, and TET2. These analyses were performed by methylation-specific multiplex ligation dependent probe amplification (MS-MLPA), COBRA, colorimetry and fluorimetry assays, as well as real time PCR. Acute and chronic exposure to H2O2 increased TSG methylation (in cells with increased ROS/GSH ratio) and decreased LINE-1 methylation (in cells with increased GSH levels). TSG hypermethylation was cell line-dependent and accompanied by upregulation of DNMT1, DNMT3A, MECP2, HDAC1, and EZH2 genes. Moreover, the pre-treatment with N acetylcysteine, an antioxidant molecule, prevented these events. Overall, the present study points to a possible link between OS and DNA methylation, which besides the relevance in the development and progression of these MN, could also constitute new diagnostic and prognostic markers as well as new potential therapeutic targets.
As neoplasias mieloides (NM), de que são exemplo a síndrome mielodisplásica (SMD), as neoplasias mieloproliferativas (NMP) e a leucemia mieloide aguda, são um grupo heterogéneo de doenças clonais hematopoiéticas. A patogénese destas doenças pode envolver simultaneamente alterações nos níveis de stresse oxidativo (SO) e no padrão de metilação do ADN. O SO resulta do desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), geradas principalmente na mitocôndria, e a sua eliminação pelas defesas antioxidantes. Além disso, estas doenças apresentam frequentemente hipermetilação nos genes supressores de tumor (GST), como os genes P15 e P16, e alguns casos podem também apresentar hipometilação nas sequências repetitivas, nomeadamente as long interspersed nucleotide elements 1 (LINE-1). O presente estudo teve como objetivo analisar o envolvimento do stress oxidativo e da metilação do DNA no desenvolvimento e na progressão das neoplasias mieloides, de modo a avaliar o seu papel como marcadores de diagnóstico e prognóstico, e identificar variantes genéticas de susceptibilidade em genes envolvidos nesses mecanismos. Inicialmente, efetuou-se um estudo de prova de conceito de modo a avaliar o envolvimento do SO e a disfunção mitocondrial na patogénese das SMD, o seu valor como marcadores de diagnóstico e de prognóstico, e a relação dos parâmetros OS (níveis intracelulares de peróxidos, anião superóxido e glutationa reduzida – GSH) com o perfil de metilação dos promotores dos genes P15 e P16. Para este efeito, recorreu-se a duas técnicas: citometria de fluxo e PCR específico de metilação (MSP). Os resultados demonstram que as células de medula óssea dos doentes SMD apresentam aumento dos níveis de peróxidos e diminuição de GSH, relativamente às células dos controlos. No entanto, estes resultados dependem do subtipo de SMD e do grupo de risco. Além disso, a GSH revelou-se um bom marcador de diagnóstico, enquanto os ROS, a GSH e a razão superóxido/peróxidos mostraram-se marcadores de sobrevivência. Estes doentes apresentam frequências de metilação dos genes P15 e P16 mais elevadas do que os controlos. Por outro lado, os doentes SMD com metilação nos gene P15, P16, e P15 ou P16 apresentam níveis de SO mais elevados do que os doentes sem metilação. De modo a confirmar estes resultados, realizou-se uma avaliação alargada dos parâmetros de SO (várias defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas; lesão oxidativa) de metilação do DNA [metilação localizada – perfil de metilação dos genes P15, P16, TP53, MGMT, DAPK e KEAP1; metilação global – níveis de metilação da 5-metilcitosina (5-mC), da 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) e da LINE 1] não só em doentes SMD, mas também em doentes NMP. Estes parâmetros biológicos foram avaliados em amostras de sangue periférico por colorimetria, fluorimetria, MSP e COBRA (combined bisulfite restriction analysis). Os resultados demonstraram que os doentes SMD apresentam diminuição dos níveis de GSH e CAP (capacidade antioxidante total), assim como aumento dos níveis de peróxido e das razões peróxido/GSH e peróxido/CAP comparativamente aos controlos. Por outro lado, observou-se aumento dos níveis de 5-mC e diminuição da razão 5-mC/5-hmC nos doentes SMD e NMP. Além disso, este doentes apresentam aumento da frequência de metilação de pelo menos num gene (P15, P16, DAPK, ou KEAP1). No entanto, não se observou metilação dos genes TP53 e MGMT nestes doentes. Os doentes genes metilados apresentam aumento dos níveis de peróxido e da razão peróxido/GSH relativamente aos doentes sem metilação. Por fim, os níveis de metilação da LINE-1 e da 5-mC correlacionam-se com os níveis de peróxido e da razão peróxido/GSH. Seguidamente, avaliou-se os polimorfismos em genes envolvidos no SO, no metabolismo do folato, na reparação e na metilação do DNA e o seu papel na susceptibilidade e prognóstico dos doentes SMD e LMA. Com essa finalidade, genotiparam-se 16 SNPs (um por gene: CAT, CYBA, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, GPX1, KEAP1, MPO, MTRR, NEIL1, NFE2F2, OGG1, SLC19A1, SOD1, SOD2 e XRCC1) por técnicas de PCR. Analisaram-se, igualmente, os níveis de OS (ROS/CAP), da lesão (8-OHdG) e da metilação do DNA (5-mC) num subgrupo de doentes SMD e controlos. Os resultados sugerem que os genes GPX1, NEIL1, NFE2L2, OGG1 e SOD2 influenciam a susceptibilidade para SMD, os genes DNMT3B e SLC19A1 a susceptibilidade para LMA e os genes CYBA e DNMT1 o desenvolvimento das duas doenças. Além disso, os níveis de SO correlacionam-se com o genótipo dos genes CYBA, GPX1 e SOD2, a lesão do DNA com os genes NEIL1 e OGG1, e os níveis de 5-mC com os genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B e MTRR. Os polimorfismos nos genes DNMT3A, MTRR, NEIL1 e OGG1 influenciam o prognóstico (evolução para LMA) dos doentes SMD, enquanto os polimorfismos nos genes DNMT3A, OGG1, GPX1 e KEAP1 influenciam a sobrevivência dos doentes SMD e AML. Por fim, investigou-se a influência da exposição crónica e aguda ao peróxido de hidrogénio (H2O2) na metilação de células hematológicas normais e malignas. Para o efeito, utilizaram-se quatro linhas celulares de leucemia mieloide aguda e uma linha celular de linfócitos B normal. A variação do número de cópias e o perfil de metilação de vários GST, os níveis de metilação da LINE-1, da 5-mC, 5-hmC, da 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), das ROS e da GSH, bem como a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MECP2, MBD1, HDAC1, EZH2, EP300 e TET2 foram avaliados por methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA), COBRA, colorimetria, fluorimetria e PCR em tempo real. A exposição aguda e crónica ao H2O2 induziu hipermetilação nos GST (nas células com aumento da razão ROS/GSH) e hipometilação nas sequências LINE-1 (nas células com aumento da GSH). A hipermetilação dos GST foi acompanhada da sobre-expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, MECP2, HDAC1 e EZH2 de modo dependente da linha celular. Além disso, o pré-tratamento com N-acetilcisteína, uma molécula antioxidante, preveniu estas alterações moleculares. Em conclusão, o presente estudo sugere uma possível relação entre o stresse oxidativo e a metilação do DNA, os quais, além da relevância no desenvolvimento e na progressão das neoplasias mieloides, poderão igualmente constituir novos marcadores de diagnóstico e prognóstico, bem como potenciais alvos terapêuticos.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/29610
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