The interplay of ascorbic acid, nitric oxide and nitrite in the brain and its role on the regulation of cerebral blood flow: an in vivo electrochemical study

Abstract

Ascorbate (the major form of ascorbic acid at physiologic pH) is highly concentrated in the brain, reaching 500 µM in the extracellular space and 10 mM intracellularly. It plays critical roles as a reductant, redox signaling molecule and modulator of processes linked to glutamate, the most prevalent excitatory neurotransmitter in the central nervous system (CNS), and whose dysregulation sets the background for neurodegenerative and mental disorders. Apparently, compartmentalization of ascorbate suffers dynamic and transient changes upon neural activity. Evidence suggests that ascorbate is released by a heteroexchange mechanism by which glutamate uptake triggers the outward transport of ascorbate. Thus, the concentration changes in response to neural activity rises the need for ascorbate and glutamate dynamic measurements. In the brain, stimulation of NMDA glutamate receptors also leads to the activation of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and subsequent production of nitric oxide (•NO), a free radical transmitter involved in processes like memory formation, neurovascular coupling (NVC) and neurodegeneration. Available evidence that links ascorbate and •NO metabolism was obtained mainly with in vitro systems and the literature is scarce about the dynamics and compartmentalization of ascorbate and •NO upon glutamatergic stimulation in vivo. Moreover, the hypothesis that •NO acts as a modulator of ascorbate release may help to understand some of the inconsistencies found with the heteroexchange mechanism for ascorbate release, revealing an additional player in the process of ascorbate release to the extracellular space. The dynamic interplay between ascorbate, glutamate and •NO is also determinant to satisfy the high energetic demand of the brain the constant supply of O2 and glucose during neural activity. This is satisfied through the local and transient increase in cerebral blood flow (CBF), via the mechanism of neurovascular coupling (NVC). It has recently been shown that •NO produced by nNOS mediates NVC in hippocampus under physiological conditions. However, when O2 supply is diminished (e.g., stroke, ageing), this pathway is compromised and, under hypoxic and acidic conditions, extracellular nitrite emerges as a possible source of •NO in the brain, in a process that involves its reduction by ascorbate and is independent of enzymatic control. Given the above rationale, in the first part of this work we developed a carbon fiber microelectrode (CFM) modified with a composite film of carbon nanotubes and Nafion for ascorbate real time measurements in brain tissue in vivo. The CFM exhibited an electrocatalytic activity for ascorbate oxidation by shifting negatively the peak potential to -0.040 V vs. Ag/AgCl. Glutamate-evoked changes in ascorbate in the rat hippocampus were biphasic comprising fast and slow components and the estimated basal concentration was 290 µM. In the second part of this work we coupled the use of the previously developed modified CFMs with ceramic-based Pt microelectrode arrays (MEAs) biosensors for simultaneous measurements of glutamate and ascorbate. In vivo experiments showed a delay (c.a 1 s) between the onset of glutamate and ascorbate signals, suggesting that ascorbate is released following the rise in concentration of extracellular glutamate. In the 5th chapter we tested the hypothesis that •NO produced upon NMDA receptor activation is a modulator of ascorbate release to the extracellular space. For that, we used CFMs for dynamic and simultaneous measurements of these substances in the hippocampus. Results showed that ascorbate and •NO signals had a high degree of correlation between them. Combined experiments encompassing direct stimulus with •NO and inhibitors of glutamate uptake and nNOS provided additional evidence supporting the modulator role of •NO in the release of ascorbate to the extracellular space. The observed coupling between •NO and ascorbate points to a functional impact on the activities of both compounds and lays the foundations for new regulatory mechanisms in the brain, although the precise molecular mechanism needs to be clarified. In the last chapter we tested the possibility of nitrite becoming a non enzymatic source of •NO in the brain in a process that involves its reduction by ascorbate. We used an in vivo approach for measurements of •NO, ascorbate and CBF dynamics in the hippocampus. Results showed that the localized microinjection of nitrite in animals submitted to short-term acidosis (in the absence of glutamate stimulus) induced a transient increase of 90% in •NO signals. The maximum peak amplitude of CBF signals also increased 40%. Furthermore, it was observed a decrease in extracellular levels of ascorbate coupled in time with the production of •NO. Local ejection of ascorbate oxidase induced a decrease of 65% in terms of •NO signal maximum amplitude and a decrease of 63% in CBF signals. Results support that reduction of nitrite to •NO by ascorbate occurs in the brain and underlines NVC, being particularly relevant in conditions where the synthesis of •NO from nNOS is impaired due to limited availability of O2. Finally, we observed a correlation between the supplementation with NO2- and NO3- and the increase in •NO and CBF signals, suggesting that the intake of food rich in NO3- (vegetables and fruit) may have a beneficial impact in brain perfusion, especially in ageing and other disorders that impair NVC.

O ascorbato (principal forma do ácido ascórbico ao pH fisiológico) encontra-se em elevadas concentrações no cérebro, atingindo concentrações de 500 µM no espaço extracelular e 10 mM no interior dos neurónios. Esta molécula desempenha um papel muito importante como antioxidante, sinalizador redox e modulador de processos ligados à atividade glutamatérgica. O glutamato é o neurotransmissor excitatório mais prevalente no sistema nervoso central (CNS) e a sua desregulação está na base de diferentes doenças mentais e neurodegenerativas. Aparentemente, a compartimentalização do ascorbato sofre alterações transitórias e dinâmicas durante a atividade neuronal. A literatura sugere que o ascorbato é libertado das células por um mecanismo de “heteroexchange”, no qual a internalização do glutamato extracelular se dá à custa da saída de ascorbato para o meio extracelular. Neste sentido, as alterações de concentração em resposta à atividade neuronal levantam a necessidade de efetuar medidas dinâmicas de ascorbato e glutamato. No cérebro, a estimulação do recetor NMDA do glutamato conduz também à ativação da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e subsequente produção de óxido nítrico (•NO). Este radical livre está implicado em processos como a formação de memória, acoplamento neurovascular (NVC) e neurodegenerescência. A evidência disponível que liga o ascorbato com o •NO foi obtida principalmente em sistemas in vitro e a literatura acerca da dinâmica do ascorbato e do •NO após a estimulação in vivo com glutamato é escassa. Adicionalmente, a hipótese de que o •NO produzido pode atuar como modulador da libertação de ascorbato ajuda a compreender melhor algumas inconsistências observadas no modelo de “heteroexchange” para a libertação do ascorbato, introduzindo um novo mediador no processo. A interação dinâmica entre o ascorbato, glutamato e •NO é determinante para satisfazer a elevada necessidade do cérebro em termos do aporte de O2 e glucose durante a atividade neuronal. Esta é conseguida através do aumento local e transitório do fluxo sanguíneo (CBF), num processo chamado acoplamento neurovascular (NVC). Foi recentemente demonstrado que o •NO produzido pela nNOS é um mediador do NVC no hipocampo em condições fisiológicas. No entanto, quando o aporte de O2 diminui (por exemplo em situações de acidente vascular cerebral ou envelhecimento), esta via para a produção de •NO fica comprometida e, nas condições hipóxicas e de acidose observadas nestas situações, o nitrito extracelular surge como uma fonte alternativa para a produção de •NO no cérebro, num processo que envolve a sua redução pelo ascorbato e é independente de controlo enzimático. Tendo em conta este racional, a primeira parte deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um microeléctrodo de fibra de carbono (CFM) modificado com um filme compósito de nanotubos de carbono e Nafion para medições in vivo e em tempo real de ascorbato no cérebro. O CFM desenvolvido mostrou uma atividade catalítica para a oxidação do ascorbato, tendo desviado o valor de potencial de oxidação do ascorbato para -0.040 V vs Ag/AgCl. A estimulação com glutamato induziu alterações bifásicas na concentração extracelular do ascorbato e concentração basal de ascorbato extracelular foi estimada em 290 µM. Na segunda parte do trabalho os CFMs anteriormente desenvolvidos foram utilizados em conjunto com biossensores de glutamato (MEAs) para medidas simultâneas de ascorbato e glutamato. As experiências in vivo mostraram um atraso de c.a. de 1s entre o início do sinal de glutamato e de ascorbato, sugerindo que este é libertado para o espaço extracelular na sequência do aumento da concentração de glutamato. No 5º capítulo testámos a hipótese de que o •NO produzido após a ativação do recetor NMDA é um modulador da libertação de ascorbato para o espaço extracelular. Foram usados CFMs para realizar medidas simultâneas e dinâmicas destas duas substâncias no hipocampo. Os resultados mostraram que os sinais de ascorbato e •NO têm um elevado grau de correlação entre si. Foram também realizadas experiências que envolveram o estímulo direto com •NO e inibidores da re-captação do glutamato e da enzima nNOS que evidenciaram o papel modulador do •NO na libertação do ascorbato. O acoplamento observado entre o •NO e ascorbato aponta para um impacto funcional na atividade dos dois compostos e lança as bases para novos mecanismos reguladores no cérebro, ainda que sejam necessários estudos adicionais para esclarecer o mecanismo molecular. No último capítulo testou-se a hipótese do nitrito ser uma fonte de •NO no cérebro através da sua redução pelo ascorbato. As experiências in vivo envolveram a medição dinâmica de •NO, ascorbato e CBF no hipocampo. Os resultados mostraram que a microinjeção local de nitrito em animais submetidos a acidose transitória levou a um aumento de 90% dos sinais de •NO e de 40% dos sinais de CBF. Adicionalmente, observou-se um decréscimo nos níveis extracelulares de ascorbato concomitante com o aumento de •NO. A ejeção local de ascorbato oxidase levou a um decréscimo de 65% nos sinais de •NO e 63% nos sinais de CBF. Os resultados suportam a redução do nitrito a •NO através do ascorbato no cérebro, constituindo-se como um processo alternativo para suporte do NVC, especialmente em situações em que a síntese de •NO através da nNOS esta comprometida devido à falta de O2. Finalmente, foi observada uma correlação entre a suplementação com NO2- e NO3- e o incremento nos sinais de •NO e CBF, sugerindo que a ingestão de alimentos ricos em nitratos (fruta e vegetais) pode ser benéfica na perfusão cerebral, especialmente durante o envelhecimento e outras patologias que alterem o NVC.