Non-viral silencing of Machado-Joseph disease through the systemic route

Abstract

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como ataxia espinocerebelosa do tipo 3, é uma doença neurodegenerativa e a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial. Geneticamente, esta doença é causada por uma expansão do trinucleótido CAG na região codificante do gene ATXN3/MJD1, o que confere à proteína ataxina-3 propriedades tóxicas que resultam em morte e disfunção neuronal em múltiplas regiões cerebrais. Até ao momento, não há nenhum tratamento que modifique a progressão da doença e, consequentemente, esta permanece uma doença fatal e incurável, para a qual as únicas opções disponíveis consistem na utilização de fisioterapia e compostos farmacológicos para aliviar sintomas específicos. O silenciamento de genes através do mecanismo de interferência de RNA (iRNA), representa uma das abordagens mais diretas para o tratamento da DMJ, permitindo bloquear a produção da proteína causadora da doença, e assim impedir a progressão da doença. Estudos anteriores exploraram o potencial da iRNA para o tratamento da DMJ e mostraram a sua eficácia em diferentes modelos animais. No entanto, estas experiências bem-sucedidas envolveram a administração intracraniana de vetores virais sendo desejável um procedimento menos invasivo e mais seguro. Portanto, o objetivo deste projeto foi desenvolver uma estratégia não-viral para entregar sequências silenciadoras ao cérebro através de uma via de administração não-invasiva, e a avaliação do seu potencial terapêutico em dois modelos animais geneticamente modificados da DMJ. Na primeira parte deste projeto, descrita no capítulo 2, gerámos com sucesso nanopartículas de base lipídica – SNALPs – direcionadas para o cérebro através da incorporação de um pequeno peptídeo derivado da glicoproteína do vírus da raiva (RVG-9r). Estes SNALPs direcionados para o cérebro apresentaram características importantes para administração sistémica: elevada eficiência de encapsulação para siRNAs, capacidade de proteger os siRNAs encapsulados, tamanho de partículas homogéneo e adequado. Estudos de citometria de fluxo e microscopia confocal revelaram a entrega específica dos siRNAs a células neuronais, in vitro. Além disso, os SNALPs direcionados para o cérebro diminuíram significativamente os níveis da ataxina-3 mutante, a proteína que causa a DMJ, numa linha celular neuronal. Experiências in vivo demonstraram que o peptídeo RVG-9r aumentou a acumulação das nanopartículas no cérebro de murganhos, após administração intravenosa, um dos objetivos mais importantes deste projeto. No capítulo 3, avaliámos o potencial terapêutico da administração intravenosa de SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r num modelo lentiviral murino da DMJ. Os nossos estudos facultam evidências que a administração não-invasiva de SNALPs direcionados para o cérebro diminuiu o número de inclusões ubiquitina-positivas e mediou neuroprotecção num modelo murino lentiviral e estriatal da DMJ, um resultado extremamente promissor. Por fim, no capítulo 4, como o cerebelo é uma das regiões cerebrais mais afetadas nos doentes de Machado-Joseph, avaliámos a eficácia e os resultados do silenciamento da ataxina-3 mutante usando SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r num modelo murino transgénico cerebelar da DMJ, quando implementado após o início da doença. Os SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r internalizaram no parênquima cerebelar, onde os siRNAs entregues reduziram os níveis de ataxina-3 mutante, melhoraram o desempenho motor dos animais, atenuaram a neuropatologia e não induziram uma resposta imune evidente, constituindo assim uma terapia promissora para a DMJ. Em resumo, esta dissertação apresenta evidências que uma formulação clinicamente relevante baseada em nanopartículas é uma estratégia terapêutica promissora para tratar a DMJ. Os nossos estudos reforçam outros que revelaram os benefícios da iRNA para a terapia da DMJ, revelando uma nova estratégia que tem um elevado potencial para ser utilizada na prática clínica para o tratamento de diversas doenças neurodegenerativas ligadas à produção de proteínas patogénicas.

Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is a neurodegenerative disorder and the most common autosomal dominantly-inherited ataxia worldwide. Genetically, this disorder is caused by the over-repetition of a CAG tract in the coding region of the ATXN3/MJD1 gene, which confers a toxic gain-of-function to the ataxin-3 protein leading to neuronal dysfunction and degeneration in multiple brain regions. No effective disease-modifying treatment was developed for MJD so far, consequently it remains a fatal and incurable disease for which the only available options consist in the use of physiotherapy and pharmacological compounds to alleviate some specific symptoms. Gene silencing by RNA interference (RNAi) mechanism represents one of the most straightforward approaches for MJD treatment enabling to block the production of the disease-causing protein, in an attempt to stop disease progression. Studies exploring the RNAi potential for the treatment of MJD showed its efficacy in different animal models. However, successful experiments involved intracranial administration of viral vectors, and there is a need for a safer and less invasive procedure. Therefore, the aim of this project was to develop a non-viral strategy to deliver small interfering RNAs (siRNAs) to the brain by a non-invasive administration, and the evaluation of its therapeutic potential in two genetically-modified mouse models of MJD. In the first part of this project, described in chapter 2, we successfully generated brain-targeted stable nucleic acid lipid particles (SNALPs) through the incorporation of a short peptide derived from rabies virus glycoprotein (RVG-9r). Brain-targeted SNALPs exhibited important characteristics for systemic delivery: high encapsulation efficiency of siRNAs, ability to protect the encapsulated siRNAs, appropriate and homogeneous particle size distribution. Flow cytometry and confocal microscopy studies revealed specific in vitro delivery of siRNAs to neuronal cells. Moreover, brain-targeted SNALPs efficiently decreased mutant ataxin-3 levels, the MJD-causing protein, in a neuronal cell line. Importantly, in vivo experiments demonstrated that the RVG-9r peptide increased the accumulation of the nanoparticles in the mouse brain, upon intravenous administration. In chapter 3, we evaluated the therapeutic potential of intravenous administration of RVG-9r-targeted SNALPs in a lentiviral-based mouse model of MJD. Notably, our studies provided evidences that non-invasive administration of brain-targeted SNALPs decreased the number of ubiquitin-positive inclusions and mediated neuroprotection in a striatal lentiviral-based mouse model of MJD. Lastly, in chapter 4, as cerebellum is one of the mostly affected brain-regions in MJD patients, we evaluated the efficacy and outcomes of mutant ataxin-3 silencing using RVG-9r-targeted SNALPs in a cerebellar-transgenic mouse model of MJD, when implemented after disease onset. Importantly, brain-targeted SNALPs internalized in the cerebellar parenchyma, where the carried siRNAs reduced mutant ataxin-3 levels, alleviated motor performance defects, rescued neuropathology and did not induce a strong immune response, constituting a promising therapy for MJD. In summary, the present thesis provides evidence that a clinically-relevant nanoparticle-based formulation is a promising therapeutic strategy for MJD patients. Our data strengthen other studies that revealed the benefits of RNAi for MJD therapy, disclosing a new strategy that has a high potential to be used in the clinic for the treatment of several neurodegenerative diseases known to be linked to the production of pathogenic proteins.