Activity-dependent changes in the dendritic distribution of hnRNP K : functional implications

Abstract

Neurons communicate with each other through highly specialized structures, the synapses, and the synaptic strength can be bidirectionally modulated. Long-term potentiation (LTP) refers to a long-lasting enhancement of the excitatory synapse strength which may be induced by high-frequency presynaptic stimulation or by pairing low-frequency presynaptic stimulation with postsynaptic depolarization. Experimental evidence relates LTP to memory acquisition and learning, especially at the hippocampus. The late stages of LTP require local synthesis of specific proteins and, accordingly, the essential cellular machinery required for translation activity was found at the vicinities of synapses. Furthermore, LTP is associated with structural changes of dendritic spines, namely their enlargement. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a neurotrophin capable of modulating synaptic transmission and is a mediator of latephase LTP at hippocampal synapses. BDNF has been implicated, among other functions of the neurotrophin, in the control of mRNA localization in dendrites, in the regulation of translation machinery activity, as well as in spine plasticity. Heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein K (hnRNP K) belongs to the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein family of proteins and binds nascent transcripts. This ribonucleoprotein virtually regulates every step of mRNA biology and a recent study showed a role for hnRNP K in synaptic plasticity in the hippocampus. In this work we aimed at further characterizing the activity-dependent changes on hnRNP K levels in dendrites of cultured hippocampal neurons, as well as its possible functions in the regulation of BDNF-induced dendritic protein synthesis and surface expression of GluA1-containing AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) receptors. We developed lentiviral vectors to deliver small hairpin RNAs (shRNA) targeting hnRNP K mRNA in cultured hippocampal neurons. With this approach we validated two shRNA constructs (SH5 and SH6) with full complementarity to the rat hnRNP K mRNA which induced a strong knockdown of hnRNP K protein levels, both in the cell soma and in dendrites. Immunocytochemistry experiments showed an increase in hnRNP K protein levels in dendrites of cultured hippocampal neurons following activation of the BDNFTrkB (tropomyosin receptor kinase B) signalling cascade. Increasing synaptic activity with bicuculline also uprgulated the dendritic levels of hnRNP K through a mechanismdependent on endogenous released BDNF. These results show an important role of BDNF in the accumulation of hnRNP K in dendrites upon neuronal activation. Preliminary results obtained using a SUnSET (surface sensing of translation) methodology in both control and hnRNP K-silenced neurons also suggest an important role for this ribonucleoprotein in the regulation of dendritic protein synthesis. Finally, our preliminary findings indicate that hnRNP K may also be involved in the regulation of the surface expression of GluA1-containing AMPA receptors. Altogether, our data support the available evidence suggesting hnRNP K as a crucial player in the regulation of synapse function. Importantly, hnRNP K is likely involved in the modulation of local mRNA metabolism in dendrites which may have a role in BDNF-dependent forms of synaptic plasticity.

Os neurónios são capazes de comunicar entre eles através de estruturas altamente especializadas, as sinapses, cuja potência pode ser modulada bidireccionalmente. A potenciação sináptica de longa duração (LTP) refere-se a um aumento prolongado da força sináptica e pode ser induzida por estimulação de altafrequência do terminal pré-sináptico ou por emparelhamento de uma estimulação présináptica de baixa-frequência com despolarização da região pós-sináptica. As evidências experimentais disponíveis relacionam a LTP com a aquisição de memória e com a aprendizagem, sobretudo ao nível do hipocampo. As fases mais tardias da LTP requerem síntese local de proteínas específicas e a maquinaria celular essencial para a tradução foi encontrada nas regiões adjacentes às sinapses. A LTP está também associada a alterações nas espículas dendríticas, nomeadamente ao aumento do seu tamanho. O BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro) é uma neurotrofina capaz de modular a transmissão sináptica e mediar a fase-tardia do LTP em sinapses do hipocampo. Entre outros processos, o BDNF está envolvido na regulação da localização de mRNAs nas dendrites, assim como na regulação da actividade da maquinaria envolvida na tradução, e da plasticidade sináptica. A hnRNP K é uma proteína pertencente à família das heterogeneous nuclear ribonucleoproteins. Esta proteína ligase a sequências de RNA após a transcrição e assim tem o potencial de regular todos as etapas do seu metabolismo. Estudos recentes mostraram também que esta proteína desempenha um papel importante na plasticidade sináptica ao nível do hipocampo. Com este trabalho pretendemos caracterizar as alterações na distribuição dendrítica da hnRNP K em neurónios do hipocampo resultantes da actividade sináptica, e estudar a possível função da proteína na regulação da síntese proteica induzida por BDNF e na inserção superficial de receptores AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid) contendo a subunidade GluA1. Para tal, desenvolvemos vectores lentivirais para entregar “small hairpin RNAs” (shRNAs) que reconhecem o mRNA que codifica a proteína hnRNP K de rato, em neurónios de hipocampo em cultura. Foi possível validar duas construções de shRNA (SH5 e SH6), com completa complementaridade pelo mRNA que codifica a proteína hnRNP K de rato, as quaisinduziram uma redução significativa dos níveis desta proteína no corpo celular e nas dendrites. Através de experiências de immunocitoquímica observámos um aumento dos níveis proteicos de hnRNP K em dendrites de neurónios de hipocampo em cultura devido à activação da cascata de sinalização induzida pela interacção entre o BDNF e o receptor TrkB (tropomyosin receptor kinase B). O aumento de actividade sináptica induzido pela bicuculina fez também aumentar os níveis dendríticos da proteína hnRNP K através de um mecanismo dependente da libertação de BDNF endógeno. Estes resultados sugerem que a neurotrofina é necessária para a acumulação de hnRNP K nas dendrites em resposta à actividade neuronal. Resultados preliminares usando a técnica SUnSET (“surface sensing of translation”) em neurónios controlo ou em neurónios com níveis proteicos de hnRNP K reduzidos, sugerem igualmente um importante papel para esta ribonucleoproteina no controlo da síntese proteica ao nível das dendrites. Por fim, os nossos resultados preliminares também sugerem que a proteína hnRNP K pode estar envolvida na regulação dos níveis membranares de receptores AMPA que contêm a subunidade GluA1. Em conclusão, os nossos resultados apoiam as evidências já existentes que sugerem um papel para a proteína hnRNP K na regulação da actividade sináptica. De notar que a proteína hnRNP K poderá estar envolvida na modulação do metabolismo do mRNA nas dendrites, o que poderá ter implicações nos eventos de plasticidade sináptica dependentes do BDNF.