Candida-host interaction: role of purine and adenosine A2A receptors

Abstract

Yeasts of the genus Candida spp. are members of the human body normal flora that can turn into aggressive agents of opportunistic infection, namely in individuals with immune diseases or in debilitated conditions. This is prominent in elderly individuals, where the natural immunosenescence upon aging leads to a decreased ability to control infections, including those caused by fungi. Yeast recognition and clearance by host phagocytic cells, such as macrophages, seems to be a complex procedure involving multiple recognition systems and inflammatory responses. Purines, namely extracellular ATP and adenosine, operate an important role in immunity and inflammation homeostasis. In particular, the adenosine A2A receptor (A2AR) critically contributes to the fine-tuning of inflammatory and immune responses, prompting an efficient elimination of threats while minimizing tissue damage. This dissertation aims to explore the hypothesis that adenosine and its sensing devices may constitute one of the systems exploited by Candida spp., in particular by Candida albicans, to modulate the response of macrophages, bolstering its pathogenic success. This study focused on the role of A2AR in the efficiency of the phagolysosome to clear yeasts. Several approaches were used to study the in vitro interaction between C. albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis or Saccharomyces cerevisiae with a macrophage cell line. It was observed that upon infection with those yeasts, there was no increase of A2AR gene expression in contrast to the 11-fold increase of A2AR gene expression upon exposure of macrophages to lipopolysaccharide (LPS) from Gram negative bacteria. Furthermore, upon yeast infection, A2AR localize around phagosomes containing yeasts cells. The use of pharmacological approaches, with both A2AR agonists and antagonists, as well as peritoneal macrophages from A2AR knockout mice, allowed concluding that A2AR control the phagocytic efficiency of macrophage to internalize and clear C. albicans cells. Moreover, during the course of infection C. albicans decreased the extracellular levels of ATP, a danger signal contributing to stimulate inflammation leading to clearance of pathogens, thus forcing a lower efficiency of macrophages. Adding to this, total ectophosphatase activity decreased from about 20 to 17 nmol Pi h-1 10-6 cells (p<0.01), while ecto-5’nucleotidase activity did not change; this is interpreted as the need to control the formation of another purinergic signal controlling macrophage reactivity – adenosine during the early phase of C. albicans infection. To tackle the contribution of C. albicans ecto-nucleotidases or ectophosphatases to its pathogenesis, an enzymatic study revealed some special properties of the enzymes relevant for the yeast survival inside the phagolysosome, such as the finding that their maximal enzyme activity was recorded under an acidic pH of 4. Finally, an in vivo model of sustained C. albicans-gastrointestinal infection was constructed with the objective of defining the involvement of A2AR on the susceptibility to yeast infection and on the inflammatory response of gastrointestinal tissues from young, adult and aged mice; this allowed to establish a correlation between infection, inflammation, ageing and A2AR localization in the gastrointestinal tract. Overall, the work presented here shows that upon interaction with macrophages, Candida is able to change immune and inflammatory responses by modulating both the source of adenosine activating A2AR and by re-directing A2AR: this favors the silencing of macrophages responses and is proposed to constitute a novel strategy contributing to the success of Candida spp. as pathogens but also for the persistence of endogenous reservoirs of opportunistic agents of infection.

As leveduras do género Candida spp. são elementos da flora normal do organismo humano, mas também importantes agentes de infecção fúngica oportunista, particularmente em indivíduos com alterações do sistema imunitário ou muito debilitados. Também a imunossenescência natural, associada ao envelhecimento humano, leva a uma diminuição da capacidade de controlar as infecções, nomeadamente as fúngicas. O reconhecimento e erradicação de uma infecção fúngica pelo hospedeiro depende de células fagocíticas, tais como os macrófagos, sendo um processo complexo que envolve vários sistemas de reconhecimento e de resposta imune-inflamatória. Um importante sistema de homeostasia na imunidade e inflamação é operado pelas purinas, nomeadamente o ATP e a adenosina extracelulares. Em particular, o receptor A2A de adenosina (A2AR) contribui para este delicado controlo das respostas inflamatórias e imunológicas, eliminando as ameaças de forma eficiente e minimizando os danos infligidos. Esta dissertação visa explorar a hipótese de que a adenosina e os seus receptores podem constituir um dos sistemas explorados por Candida spp., em particular por Candida albicans, o principal agente de infecção fúngica humana, para modular a resposta de macrófagos, reforçando o seu sucesso como agente patogénico. Este estudo incidiu sobre o papel dos receptores de adenosina, os A2AR, na eficiência do fagolisossoma para eliminar leveduras. Utilizaram-se várias abordagens para estudar a interacção in vitro entre C. albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis ou Saccharomyces cerevisiae e uma linha celular de macrófagos. Observou-se que, após a infecção com essas leveduras, não ocorria aumento da expressão do gene Adora2a, que codifica para os A2AR, em contraste com o aumento de 11 vezes registado para a expressão do gene Adora2a em macrófagos tratados com lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram negativas. Paralelamente, observou-se que a exposição a fungos forçou os A2AR a localizarem-se em torno da membrana dos fagossomas dos macrófagos que continham células de leveduras. A utilização de uma abordagem farmacológica, com agonistas e antagonistas dos A2AR, assim como o uso de macrófagos peritoneais de ratinhos com delecção genética (knockout) dos A2AR, permitiu demonstrar que os A2AR controlavam a eficiência fagocítica dos macrófagos na internalização de C. albicans e na produção de moléculas sinalizadoras. Ademais, durante a infeção com C. albicans, a levedura estudada à qual está associada maior virulência, a quantidade de ATP extracelular, um sinal de perigo que estimula a inflamação conducente à eliminação dos agentes patogénicos, não aumenta, levando, assim, a uma menor eficiência dos macrófagos. Já durante a infecção por C. glabrata e S. cerevisiae, menos virulentos, há um aumento significativo do ATP extracelular. Para além disto, no decurso da infecção por C. albicans, a atividade total ecto-fosfatásica, diminuiu de cerca de 20 para 17 nmol Pi h-1 10-6 células (p<0.01), enquanto que a atividade total ecto-5'-nucleotidásica se manteve constante. Para compreender a possível contribuição das ecto-nucleotidases ou ecto-fosfatases de C. albicans para o seu mecanismo de patogenicidade, foi realizado um estudo para esclarecer as propriedades dessas enzimas em C. albicans, tendo-se determinado que, nesta levedura, algumas particularidades destas enzimas poderão estar relacionadas com a sua capacidade de sobreviver ao ambiente do fagolisossoma, como o facto da atividade enzimática máxima se registar a um pH ácido de 4.0. Finalmente, foi construído um modelo gastrointestinal de infecção por C. albicans com o objetivo de decifrar o envolvimento dos A2AR na susceptibilidade à infecção e na resposta inflamatória dos tecidos gastrointestinais de ratinhos jovens, adultos e idosos, o que permitiu estabelecer uma correlação entre infecção, inflamação, envelhecimento e localização dos A2AR nos tecidos do trato gastrointestinal. Assim, o trabalho aqui apresentado demonstra que, após interação com os macrófagos, Candida, em particular C. albicans é capaz de modular o ATP extracelular, impedindo o seu aumento e afectando desta forma o seu efeito pro-inflamatório; por outro lado, força a re-localização dos A2AR para a membrana do fagossoma, o que contribuirá para o silenciamento da resposta dos macrófagos à infeção, contribuindo não só para o seu sucesso como agente patogénico, mas também para a manutenção dos reservatórios endógenos de agentes de infecção oportunista.