Berberine modulation on doxorubicin-induced cell death and auto phagy

Abstract

Doxorubicin (DOX) is a widely prescribed and effective anti-cancer agent. The clinical use of DOX has been associated mainly with a cumulative and dosespecific cardiotoxicity that involves the development of congestive heart failure. DOX-induced delayed cardiomyopathy may occur or be aggravated through the decrease of cardiac progenitor cells pool in juvenile patients. In fact, has been reported that, DOX progressively decreases the pool of cardiac progenitor cells which combined with oxidative damage can lead to a progressive decrease in cardiomyocyte number. Oxidative stress is in fact a major event responsible for many alterations observed in normal cardiac cell function during DOX toxicity. Increased ROS generation induces alterations in ion homeostasis, alterations in iron metabolism, disruption of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction. DOX-induced free radical formation leads to pathological alterations in lipids, proteins, nucleic acids and biomolecules which can result in the mobilization of apoptotic machinery and consequent caspase activation. Autophagy may act as a compensatory mechanism that can control cell damage and restore energy homeostasis during DOX cardiac toxicity. If autophagy becomes uncontrolled this might lead cardiomyocyte to apoptosis, resulting in increased DOX toxicity. Because of the importance of DOX on anti-cancer therapy, new compounds that can inhibit the toxicity are needed. Berberine (BER) is a natural compound used in traditional chinese medicine that besides it cardioprotective properties, can modulate DOX-induced cardiotoxicity. The objective of this work is to understand if BER can modulate cell death and autophagy in H9c2 cells treated with DOX. To understand the effect of BER on DOX-induced cell death and autophagy, H9c2 cells were pre-treated with BER 48 hours before DOX administration (24 hours). Cell viability, caspases and cathepsins activity, mitochondria-lysosome co-localization and autophagy markers were measured in this work. Our results showed that BER inhibit DOX-induced caspases 9 and 3- like activation. In addition, BER appeared to inhibit autophagy in cells treated withDOX. Moreover, BER was unable to prevent DOX-induced mitochondrial alterations. Nevertheless, mitochondrial biogenesis markers were upregulated by BER in the presence of DOX. Although several mitochondrial alterations were not prevented by BER, apoptosis and autophagy were decreased by that alkaloid. Although more studies are needed, this combination could translate in future therapeutic strategies to allow the use of higher cumulative doses in DOX- cancer chemotherapy, proven that BER does not impair DOX anti-cancer efficacy.

A Doxorubicina (DOX) é um fármaco eficaz contra lesões neoplásticas globalmente prescrito. O uso prolongado da DOX tem sido associado a cardiotoxicidade que é dependente da dose utilizada e da sua acumulação no coração. A acumulação tecidual da DOX tem sido relacionada com o desenvolvimento de falha cardíaca congénita. A Cardiomiopatia induzida pela DOX que anos depois do último tratamento poderá ocorrer ou ser agravada devido à diminuição da quantidade de células progenitoras cardíacas em pacientes de idade pediátrica. Sabe-se que a DOX leva ao decréscimo progressivo da quantidade de células cardíacas progenitores presentes no coração o que combinado com o dano oxidativo pode levar à diminuição da quantidade de cardiomiócitos. O stresse oxidativo é o maior evento responsável pelas alterações na função normal em células cardíacas saudáveis quando exposta à toxicidade da DOX. O aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio leva a alterações no metabolismo do ferro, alterações na homeostase iónica e à disfunção mitocondrial. A formação de radicais livres e o aumento do stresse oxidativo leva a sérias alterações nos lípidos, nos ácidos nucleicos e em biomoléculas importantes que resultam em acumulação de danos celulares e à mobilização de maquinaria apoptótica que culmina na activação de caspases. A autofagia pode actuar então como um mecanismo compensatório de controlo de danos celulares e de recuperação da homeostase energética durante a cardiotoxicidade induzida pela DOX. No entanto, se o fluxo autofágico se torna descontrolado pode levar ao desencadeamento de outros processos de morte celular, podendo agravar o desenvolvimento de cardiomiopatias. Tornou-se então importante a procura de novos compostos que inibissem a toxicidade provocada pela DOX, devido à sua importância clinica no tratamento contra o cancro. A Berberina, composto natural muito utilizado na medicina tradicional chinesa, apresenta propriedades cardioprotectoras que parecem modular a cardiotoxicidade provocada pela DOX. O objectivo deste trabalho foi perceber em que se a BER consegue modular a morte celular e a autofagia em cardiomioblastos H9c2 tratados com DOX. Para perceber o seu efeito, as células H9c2 foram pré-tratadas com BER 48 horasantes da administração com DOX (24 horas). Foi avaliado o efeito da BER na viabilidade celular; na actividade de caspases e catepsinas; na co-localização entre mitocôndrias e lisossomas; e em marcadores de autofagia. Os nossos resultados mostraram que a BER conseguia inibir a activação das caspases 3 e 9 provocada pelo tratamento com DOX em células H9c2. A BER também pareceu capaz de inibir a autofagia em células tratadas com DOX. A BER, no entanto, não pareceu induzir capaz de prevenir as alterações mitocondriais provocadas pela DOX. Apesar disso, os marcadores de biogénese mitocondrial estavam aumentados em células tratadas com BER e DOX. Em suma, a BER não preveniu as alterações mitocondriais, apesar de ter prevenido a apoptose e autofagia. É interessante continuar a avaliar este efeito da BER e não é de descartar a hipótese da combinação de BER e DOX poder ter novas aplicações terapêuticas, permitindo o uso da DOX em doses cumulativas mais elevadas no tratamento contra o cancro, desde que não afecte a eficácia anti-neoplásica da DOX.