Embriogénese somática em genótipos de Quercus suber análise bioquímica e histológica de produtos de reserva

Abstract

Quercus suber (sobreiro) é uma planta com um grande interesse económico devido à produção de cortiça, sendo Portugal o principal produtor. A propagação tradicional da espécie por técnicas de multiplicação vegetativa permite assegurar a propagação clonal, mas apresenta fortes limitações, pelo que têm sido desenvolvidos métodos para a propagação do sobreiro utilizando técnicas de cultura in vitro. Assim, a embriogénese somática foi induzida nesta espécie a partir de explantes de origem adulta. Primeiramente, calos embriogénicos obtidos num meio rico em auxinas (2,4-D e NAA) e citocininas (KIN e BAP) a partir de folhas obtidas por abrolhamento de estacas de diferentes árvores, foram subcultivados para um meio com menores concentrações de reguladores de crescimento (NAA e BAP), surgindo embriões somáticos em diferentes estádios aquando da cultura num meio sem hormonas. Os embriões somáticos primários têm capacidade de sofrer embriogénese recorrente em meios com NAA e BAP, ocorrendo a sua maturação num meio sem reguladores de crescimento. A combinação de reguladores de crescimento que deu melhores resultados foi 50 μM NAA + 10 μM BAP. Noutros genótipos, para os quais os calos já estavam previamente induzidos de acordo com o mesmo protocolo, obtiveram-se embriões somáticos em quatro estádios de desenvolvimento (desde um estádio precoce globular até um estádio cotiledonar bem desenvolvido), pelo cultivo num meio sem reguladores de crescimento com subculturas feitas a cada 6 semanas, e em condições de 16h luz:8 h escuro. Para compreender melhor o desenvolvimento dos embriões somáticos nesta espécie, analisaram-se bioquímica e histoquimicamente os níveis de compostos de reserva (proteínas, lípidos e amido) nos quatro estádios de desenvolvimento dos embriões, comparando com os valores obtidos para embriões zigóticos (cotilédones e eixos embrionários). Os resultados mostraram que o teor em reservas dos embriões somáticos era sempre inferior ao dos embriões zigóticos. Durante o desenvolvimento dos embriões somáticos o teor de reservas variava em função do estádio de desenvolvimento tendo-se verificado um aumento do teor de amido e proteína, enquanto no caso dos lípidos se verificou um valor constante, sendo o teor particularmente elevado na fase de calo embriogénico. Os perfis proteicos obtidos por SDS-PAGE das várias amostras de embriões somáticos e de eixos embrionários zigóticos mostraram uma maior expressão de determinadas bandas (60 kDa, 46 kDa e 26 kDa) em embriões mais desenvolvidos enquanto outrasapresentavam uma nítida redução (30 kDa, 40 kDa e 50 kDa). Verificou-se ainda que o perfil proteico encontrado em embriões somáticos maduros é semelhante ao perfil proteico originado por embriões zigóticos, embora com algumas diferenças que poderão explicar a dificuldade que os embriões somáticos têm em germinar. Os resultados mostraram ainda ser possível a obtenção de material embriogénico e não embriogénico a partir dos embriões somáticos, situação que permitirá no futuro a realização de estudos de proteómica e genómica entre os dois tipos de calo com o objetivo de identificar fatores envolvidos no controlo da embriogénese somática.

Quercus suber (cork oak) is a plant with a big economic interest due to the production of cork, Portugal being the main producer. Traditional propagation of this species through vegetative multiplication techniques ensures clonal propagation, although presenting strong limitations. Because of that, in vitro culture techniques have been developed for the propagation of cork oak. Somatic embryogenesis was induced in this species through the culture of explants of adult trees. First, embryogenic calli were obtained on an auxin (2,4-D and NAA) and cytokinin (KIN and BAP) containing medium, from leaves sprouted in the greenhouse. Then they were transferred to media containing lower concentrations of plant growth regulators (NAA and BAP) and then to an auxin-free medium, where somatic embryos appeared. These somatic embryos showed the capacity to develop repetitive embryogenesis in media containing NAA and BAP, with the secondary embryos developing in PGR free media. The best PGR combination for the induction of somatic embryos was 50 μM NAA + 10 μM BAP. Calli from other genotypes, previously induced with the same protocol, originated somatic embryos which were grouped in 4 different development stages according to their appearance (from a premature with a globular aspect embryo, until a mature embryo stage) when subcultured to PGR free media on 16h:8h light: dark conditions, on 6 weeks intervals. To better understand somatic embryo development in this species, the 4 development stages were biochemically and histochemically analyzed for storage product accumulation (proteins, lipids and starch), and compared with zygotic embryos (cotyledons and embryonary axis). The results showed that reserve compounds in somatic embryos were always lower than in zygotic embryos. During somatic embryo development, reserves changed according to the developmental stage of the somatic embryo, with the starch and protein content being greater on the mature stages, whereas lipid content showed little variation, although being particularly high during the embryogenic calli stage. Protein profiles of the samples obtained with SDS-PAGE showed sets of protein bands (with 60 kDa, 46 kDa and 26 kDa) with an increasing expression throughout the maturation of the embryos, and another sets of protein bands (with 30 kDa, 40 kDa and 50 kDa) with reduced expression throughout the maturation of the somatic embryos. Also, the protein profile obtained in mature somatic embryos was similar to that obtained in zygotic embryos, although with some differences thatmay explain the difficulty of the somatic embryos to involve into plantlets. The results also showed that it is possible to obtain embryogenic and non-embryogenic material from somatic embryos. This will permit in the future to do proteomic and genomic comparisons between the two types of calli so that the factors involved on the control of somatic embryogenesis can be identified.