Resistance to recombinant human erythropoietin therapy - studies in experimental models of anemia and chronic kidney disease

Abstract

A doença renal crónica (DRC) é uma doença que afeta cerca de 7% das pessoas com mais de 30 anos, traduzindo-se em mais de 70 milhões de pessoas em países desenvolvidos por todo o mundo. A anemia é uma complicação da DRC que se desenvolve no início da doença, aumentando a sua frequência e gravidade com o declínio da função renal. Esta patologia tem sido principalmente associada à diminuição da produção de eritropoietina, através da falência renal e de outros fatores, tais como a inflamação crónica, a perda de sangue e deficiências em vitaminas. A terapêutica com eritropoietina recombinante humana (rHuEPO) para tratar a anemia associada à DRC reduziu os requisitos de transfusões e melhorou a qualidade de vida dos doentes. No entanto, existe uma grande variabilidade na resposta ao tratamento, e cerca de 10% dos doentes desenvolvem resistência à terapêutica com EPO, agravando o seu prognóstico. Apesar da investigação dos últimos anos, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de resistência à rHuEPO permanecem ainda por elucidar. Modelos animais poderão ser ferramentas úteis para clarificar as características celulares e moleculares desta condição. Os nossos objetivos foram, usando um modelo animal de DRC induzida por nefrectomia (5/6), esclarecer os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de anemia e à evolução de lesão renal; estudar o efeito da rHuEPO per se; compreender a variabilidade na resposta/resistência ao tratamento com rHuEPO, focando a eritropoiese, o metabolismo de ferro, assim como as lesões renais, a hipóxia, a inflamação e a fibrose, no sangue, nos tecidos e a nível celular; finalmente, desenvolver modelos animais experimentais que possam ser úteis noutros estudos de anemia associada à DRC. Tal como esperado, o nosso modelo desenvolveu uma anemia precoce logo após a nefrectomia que persistiu durante o estudo. A anemia persistente não foi devida a uma deficiência de EPO pois o rim remanescente dos ratos foi ainda capaz de produzir EPO (níveis aumentados em soro), e o fígado pareceu aumentar a expressão génica de EPO, sugerindo que o rim remanescente, ou mesmo os tecidos extra-renais, foram capazes de compensar a produção de EPO. Além disso, a redução na expressão da hepcidina, provavelmente induzida por hipoxia, deve favorecer a absorção de ferro. Os nossos resultados sugerem que a persistência da anemia pode resultar de distúrbios no metabolismo do ferro e, eventualmente, de uma alterada actividade/função da EPO que pode resultar do dano nas células do rim, e da inflamação local desenvolvida. A fim de elucidar os mecanismos subjacentes à persistência da anemia, foi utilizado o modelo animal previamente caracterizado, para avaliar o impacto de duas doses de rHuEPO (50 e 200 UI) nos mecanismos mencionados, nomeadamente na (dis)funcionalidade da EPO, no (dis)metabolismo e disponibilidade do ferro, na hipóxia renal, na inflamação e na fibrose do rim remanescente. Neste modelo de DRC, a anemia desenvolvida a longo prazo foi devida a uma atividade eritropoiética reduzida, uma vez que ratos com DRC foram capazes de corrigir a anemia quando tratados com rHuEPO; a inflamação local renal e o tipo (ligeiro ou avançado) de lesões renais são cruciais para o resultado desta anemia. O tratamento de ratos com DRC com rHuEPO leva ao desenvolvimento de anticorpos anti-rHuEPO e, por conseguinte, à anemia, após 9 semanas de tratamento. Além disso, o impacto deste tratamento depende da dose de rHuEPO usada, que deve ser suficiente para corrigir a anemia, prevenindo o rim e a hipertrofia cardíaca, mas não demasiado elevada pois conduzirá a um agravamento de lesões renais glomerulares e tubulointersticiais. Adicionalmente, a possibilidade do desenvolvimento de resistência à EPO exógena (tratamento com rHuEPO) foi também considerada e analisada pelo desenvolvimento de um modelo de rato de hipoplasia eritróide mediada por anticorpos induzida por rHuEPO, através de um tratamento a longo prazo com uma alta dose de rHuEPO (200 UI/Kg de peso corporal/semana) durante 9 semanas em ratos Wistar. Os resultados obtidos sugeriram que, neste modelo, os anticorpos anti-rHuEPO inibiram tanto a rHuEPO como EPO endógena levando à anemia; adicionalmente, o ferro estava aumentado, induzindo a expressão da hepcidina hepática, apesar da não evidência de inflamação, sendo ele o modulador chave de síntese hepcidina. Os resultados desta tese dão-nos mais conhecimento sobre os mecanismos subjacentes a diferentes respostas do tratamento com rHuEPO observado nos doentes com DRC, assim como sobre o desenvolvimento de resistência à rHuEPO; além disso, pode abrir novas janelas para identificar alvos terapêuticos putativos para esta condição, bem como para a resistência à rHuEPO, que ocorre em cerca de 10% dos doentes com DRC. Conseguimos também desenvolver dois modelos experimentais, de DRC e de PRCA, que são ferramentas úteis para futuros estudos, incluindo farmacológicos, nesta área.

Chronic kidney disease (CKD) is a debilitating disease affecting about 7% of people with more than 30 years and older, which translates to more than 70 million people in developed countries worldwide. Anemia is a common complication of CKD that develops early in the course of the disease, increasing its frequency and severity with the decline of renal function. It has been associated, mainly, with a reduced production of erythropoietin by failing kidneys and with other factors, including chronic inflammation, blood loss and vitamin deficiencies. Since the introduction of recombinant human erythropoietin (rHuEPO), erythropoiesis-stimulating agents (ESAs) have been used to treat CKD associated-anemia, reducing the requirements for transfusion and improving the quality of life in these patients. Nevertheless, there is a marked variability in the response to the treatment and about 10% of patients develop resistance to rHuEPO therapy, aggravating their prognosis. Despite the intense research during the last years, the mechanisms underlying the development of resistance to rHuEPO therapy remain unsolved. Animal models could be useful tools to clarify the cellular and molecular features of this condition. Our aims were, by using the remnant kidney rat model of CKD induced by (5/6) nephrectomy, to clarify the mechanisms underlying the development of anemia and the evolution of renal damage; to study the effect of rHuEPO per se; to understand the variability in the response/resistance to rHuEPO therapy, focusing on erythropoiesis, iron metabolism as well as on kidney lesion, hypoxia, inflammation and fibrosis, at blood, tissue and cellular levels; finally, to develop experimental animal models that can be useful in further studies on CKD associated-anemia. As expected, our model developed anemia early after nephrectomy, which persisted throughout the study. The persistent anemia was not due to EPO deficiency because the remnant kidney of rats was still able to produce EPO (increased serum EPO levels), and the liver seems to increase EPO gene expression, suggesting that the remnant kidney or even extra-renal tissues were able to compensate EPO production. In addition, the reduced expression of hepcidin, probably induced by hypoxia, should favour iron absorption. Our data suggest that the persistence of anemia may result from disturbances in iron metabolism and, eventually, by an altered activity/function of EPO that might result from kidney cell damage and from the developed local inflammatory milieu. In order to contribute to elucidate the mechanisms underlying the persistence of anemia, we used the animal model of CKD induced by (5/6) nephrectomy, previously characterized, to evaluate the impact of two doses of rHuEPO (50 and 200IU) on the physiological/pathophysiological procedures above mentioned, namely EPO (dys)functionality, iron (dys)metabolism and availability, kidney hypoxia, inflammation and fibrosis of the remnant kidney. In this rat model of CKD, the anemia developed with long-term CRF is due to the synthesis of EPO with a reduced erythropoietic activity, as the CRF rats were able to overcome the anemia when treated with rHuEPO; the local kidney inflammation and the type (mild or advanced) of kidney lesions are crucial to the outcome of the anemia. A long-term treatment of CRF rats with rHuEPO leads to the development of rHuEPO antibodies and, therefore, to anemia, after about 9 weeks of treatment. In addition, the impact of this treatment depends on the rHuEPO dose, which should be enough to correct anemia, preventing kidney and heart hypertrophy, but not too high that will lead to worsening of advanced glomerular and tubulointerstitial kidney lesions. In addition, the possibility of development of resistance to exogenous EPO (rHuEPO therapy) was also considered and analyzed by the development of a rat model of antibody-mediated EH induced by rHuEPO, by long-term treatment with a high dose of rHuEPO (200 IU/Kg bw/week) during 9 weeks in Wistar rats. The results obtained suggested that in this model the formation of anti-rHuEPO antibodies inhibited both rHuEPO and endogenous EPO leading to anemia; in addition, iron was increased, triggering hepatic hepcidin expression, despite no evidence of inflammation, and is the key modulator of hepcidin synthesis. The findings of this thesis give further insights into the mechanisms behind the different responses to rHuEPO treatment observed in chronic kidney disease patients, as well as to the development of resistance to rHuEPO; moreover, it might open new windows to identify putative therapeutic targets for this condition, as well as for rHuEPO resistance, which occurs in about 10% of CKD patients. We managed also to develop two experimental models, of CKD and of PRCA, that will provide useful tools for further studies in this research area and, eventually, in pharmacological studies.